微小液滴を使った微生物の共培養法の確立

• Project/Area Number: 19K15742
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 小堀 峻吾 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 開発研究員 (20792691)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2020-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2019: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 微小液滴 / 微生物 / 共培養 / 共生 / W/Oエマルション / 難培養性微生物 / 次世代シーケンサー / 共生ネットワーク

Outline of Research at the Start

地球上には1兆種の微生物が存在し、99%以上は難培養性である。微生物同士は複雑なネットワークを構築しているため、共生関係を形成していることが多い。本研究では、環境中の細菌群が内包する共培養の最小ユニットを高効率に検出するシステムの構築を目的として、マイクロ流路を用いた微小液滴技術と次世代シーケンサーを活用した研究を行う。本研究から培養が可能な共生関係にある細菌群の組み合わせを網羅的に解明することができ、さらには難培養微生物の新規培養技術となることが期待される。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、環境中の細菌群中にある共培養の最小ユニットを高効率に検出するシステムの構築を目的とした。マイクロ流路と呼ばれる微細加工されたデバイスと、次世代シーケンサによるアンプリコンシーケンスを組み合わせることで、共培養系を高効率かつ網羅的にスクリーニングする系を確立する。
系の確立のために、まずは菌の区画化を試験した。共培養の最小ユニットを知るためには、最低限の菌の組み合わせを１つの区画に封入する必要がある。まず、土壌から細菌群を抽出し、液中に含まれる菌数を血球計算盤を用いて測定した。液滴の径およびポアソン分布から、１つの液滴区画に１つもしくは２つの細菌が入るよう最適な細菌濃度を計算し、抽出液を希釈した。この希釈液を内液として使用しW/Oエマルションを作成した。液滴内の菌数を測定したところ、計算値であるポアソン分布と近い分布が得られた。
微小な液滴内で共生的に細菌が増殖するには、栄養素やシグナルなど何かしらの物質の交換が必要である。そのため、液滴内で栄養の交換が成されているかを確認するために、人工的な共生関係を構築した。大腸菌ゲノム中のアミノ酸合成遺伝子を一部欠損させ、外部からのアミノ酸の供給がないと増殖できない株を、それぞれアミノ酸を補完する形で2種類（AまたはB）用いた。すなわち同じ区画内にAおよびB株がそれぞれ存在し、アミノ酸の交換が成されている場合にのみ、それぞれの株が増殖できることになる。実際にAおよびB株の大腸菌液を混ぜ合わせ、最適な濃度に培養液で希釈し区画化したところ、AB両方が存在する液滴で菌の増殖が確認できた。このことから、微小な液滴内でも栄養素の交換が成されていることがわかった。以上の研究により、微小液滴内で共培養を行う実験の基礎条件を確立することができた。