Development of a general method for plastid transformation using genome editing

Research Project

Project/Area Number	19K15836
Research Category	Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Basic Section 39030:Horticultural science-related
Research Institution	Institute of Physical and Chemical Research
Principal Investigator	渡邊健太国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 特別研究員 (40823472)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2021-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help	¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000) Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000) Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000) Fiscal Year 2019: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Keywords	葉緑体形質転換 / ゲノム編集 / 葉緑体 / CPP / 形質転換
Outline of Research at the Start	葉緑体（プラスチド）を利用した有用物質生産の産業応用への期待が近年高まっているが、プラスチドの形質転換が可能な植物種は限られている。本研究では、近年発展の著しいゲノム編集技術をプラスチド形質転換に利用によることによる、高効率なプラスチド形質転換手法を提案し、その確立を目指す。さらに、特殊な機器を必要としない核酸導入方法であるペプチド法を用いることで、より汎用的で簡便な、広い植物種でのプラスチド形質転換を可能とする技術基盤の構築を目指す。
Outline of Annual Research Achievements	CRISPRシステムによりプラスチドゲノムDNAに二重鎖切断を導入することで相同組換え効率の向上を図り、これを利用した形質転換手法の確立を目指した。植物材料は、葉緑体形質転換のモデル植物であるタバコNicotiana tabacumを用いた。本年度はゲノム編集コンポーネント（Cas9およびgRNA）を葉緑体内において恒常発現するベクターコンストラクトを作成した。ベクターは、ゲノム編集コンポーネントに加え、ホモロジーアームと抗生物質選抜マーカーを含む。同様に不活化したゲノム編集コンポーネント（dCas9およびgRNA）を発現するコントロールベクターも作成した。各ベクターをパーティクルガン法によってタバコ葉片へと導入し、形質転換体の作出を行った。逆転写PCRにより形質転換体においてゲノム編集コンポーネントが発現していることを確認した。不活化コントロールに比べて、ゲノム編集コンポーネントを発現するベクターにおいてより多くの植物体が再生できたことから、二重鎖切断の導入により、葉緑体形質転換の効率が向上することが示唆された。また、標的部位において、相同組換えを伴わないDNA修復（遺伝子ノックアウト）が生じたかを検出する目的で、次世代シークエンサーによる解析を行った。標的部位において、通常の形質転換により生じるノックインを除くと、自然変異しか検出できなかった。本システムにおいて、遺伝子ノックアウトはほとんど生じないことが示唆された。