| Project/Area Number |
19K16033
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
山口 碧 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基盤技術支援センター, 基盤技術研究職員 (20593643)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | ミトコンドリアDNA / ミトコンドリアDNA量 / マウス / CRISPR/Cas9 / ミトコンドリア DNA / ミトコンドリア DNA量 / コピー数変化 / 時計遺伝子 / 時間生物学 |
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| Outline of Research at the Start |
ミトコンドリアはミトコンドリアDNA（mtDNA）を細胞内に複数コピー持ち、呼吸鎖に必須の遺伝子を有する。このため、細胞のエネルギー要求性に応じてmtDNA量は適量に調節されていると言われている。細胞のエネルギー要求性は生体の生理現象・行動の概日リズムによる支配を受け１日の間で非常に変化に富んでおり、興味深いことに、ミトコンドリア呼吸についても日周変化を示す。しかしながら、mtDNA量の日内変動やその制御機構と分子時計の相互関係については明らかにされていない。そこで本研究課題では哺乳類モデルとしてマウスの多様な組織における時間生物学的なミトコンドリアの機能維持機構の理解を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに研究代表者は、経時的に採取したマウスの特定組織においてミトコンドリアDNA (mtDNA) の量およびmtDNAの複製に関わる遺伝子の発現が時間依存的に変化していること、また、組織によってその日内変動に差があることを分子生物学的解析により明らかにし、mtDNA量が分子時計による支配を受けていることが示唆された。そこでmtDNAの量の概日的制御機構に着目し、CRISPR/Cas9システムを用いた時計遺伝子欠損マウスの作製を試みた。昨年度に引き続き、十分な切断効率を有するguide RNA (gRNA) を選定し、Cas9ヌクレアーゼとgRNA複合体 (RNP) をエレクトロポレーション法にてマウス前核期受精卵に導入した後、二細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植した。得られた産仔について、PCRとシークエンス解析により標的遺伝子の編集成否の確認を行った結果、変異個体が全く得られなかった。次に、標的を再設計し、人工合成した複数種類のgRNAおよびCas9タンパクをRNPとしてマウス前核期受精卵にエレクトロポレーションにより導入した。体外培養によって胚盤胞期胚まで発生させた後、PCRおよびシークエンス解析にて十分な切断効率を有するgRNAを選定した。続いて、同様の手順によりRNP導入後の2細胞期胚を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植したが、全く産仔を得ることができなかった。現在、標的配列の再設計を行い、引き続きKOマウスおよびコンディショナルKOマウスの作製を計画している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究課題の実施により、時計遺伝子のノックアウト (KO) マウスの作製を試みているが、胚盤胞期胚を用いた事前の切断効率の解析では効率良くゲノム編集が起きていたものの、変異マウス作製に難航しており、分子生物学的解析が当初の計画よりやや遅れていると判断した。早急に研究計画の再検討を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究実施計画に基づき、時計遺伝子欠損マウスの作製および解析を実施する。また作製したKOマウスは系統保存の目的で凍結胚・精子として適宜保存する。
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