拡張型TREEシステムを用いた新規エピゲノム編集技術の開発とがん研究への応用
| Project/Area Number |
19K16111
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
佐久間 哲史 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 講師 (90711143)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2021-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | CRISPR-Cas9 / エピゲノム編集 / がん |
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| Outline of Research at the Start |
ゲノム編集の発展技術であるエピゲノム編集は、ゲノム配列を改変することなく遺伝子の機能を制御できること、また従来不可能であった部位特異的なエピジェネティック改変を可能にすることから、ゲノム編集に劣らぬ画期的技術として注目されている。本研究では、未だ部位特異的改変が実現していないエピゲノムの編集技術を、研究代表者らが有するエフェクター集積システム“TREE”を応用することで確立する。更に、関連性が示唆されつつもメカニズムがほとんど明らかにされていない難編集性エピゲノム修飾とがんとの関連性を、確立したシステムを用いて解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、独自に開発したエフェクター高度集積技術であるTREEシステムの拡張を進めると共に、未だ実現されていないエピゲノムの改変法を確立し、該エピゲノム修飾とがんとの関連性を明らかにすることを目的としている。2019年度は、TREEシステムの拡張と様々なエピゲノム改変のための準備および初期検討を実施した。
TREEシステムは、転写活性化因子を高度に集積させることのできるプラットフォームとして2018年度に確立したシステムである（Kunii et al., CRISPR J, 2018）。本システムは、CRISPR-dCas9を基盤としつつ、sgRNAにMS2結合タンパク質（MCP）が認識するアプタマー配列を付与し、更にMCPに対してGCN4を多数連結したマルチエピトープタグを用いて、scFvを融合させたエフェクターを大量に呼び寄せることを可能にしている。TREEシステムを用いることで、特定の遺伝子の転写レベルを高度に増強できることが示されていたものの、複雑なエピゲノムの任意改変を実現するためには、より多重化・多様化したTREEシステムの確立が不可欠であった。
そこで2019年度は、TREEシステムの更なる拡張を目的として、これまでMS2のみであったアプタマーを拡張し、全てのアプタマーでの機能性を確認すると共に、従来のMS2よりも優位な特性を有するアプタマーを見出した。更に、ポリペプチド性のタグ配列についても、GCN4の他に機能性を有する2つのタグ配列を同定し、TREEシステムに組み込むことに成功した。これにより、多様化したTREEシステム、すなわちFORESTシステムの技術基盤を確立した。加えて、FORESTシステムを用いたエピゲノム改変を実施するため、FORESTフォーマットでのヒト内在性エピゲノム修飾酵素遺伝子の発現ユニットを多数構築すると共に、一部の機能性を確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TREEシステムの多重化・多様化を目指し、アプタマーとしてMS2の他にPP7、com、boxBを追加した。各アプタマー結合タンパク質に転写活性化因子を直接連結し、４種総当たりでの直交性解析を行った結果、全てのアプタマーが目的の結合タンパク質のみと結合する性質が確認できた。また、従来型のTREEシステムで使用してきたMS2システムよりも高い転写活性化能を示すアプタマーを見出すことができた。CN4以外のポリペプチド性タグ配列については、GFP11タグとMoonTagを採用し、いずれを使用した場合でもTREE型システムでの転写活性化が可能であることが示された。
以上より、多重化・多様化したTREEシステム＝FORESTシステムの技術基盤が予定通りに確立された上、従来のMS2介在システムを上回る特性を見出し、更なる高活性化をも実現することができた。2020年度に実施するエピゲノム改変のための下準備が十分に整ったと判断できるため、本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、確立したFORESTシステムを用いることで、難編集性エピゲノム修飾の改変を試みる。既にある程度の部位特異的な編集が実現されているエピゲノムの改変をより効率化することを足掛かりに、これまでに改変が試みられつつも極めて低効率で実用レベルに至っていないエピゲノムの改変や、実施例が全く報告されていない因子を用いたエピゲノム編集へと展開すると共に、複数のエピゲノム修飾の同時制御も試み、複雑なエピゲノム異常に基づくがんの発症機序の解明に役立てることを目指す。
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Report
(1 results)
Research Products
(19 results)
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[Journal Article] Pathological characteristics of <i>Ccdc85c</i> knockout rats: a rat model of genetic hydrocephalus2020
Author(s)
Konishi S, Tanaka N, Mashimo T, Yamamoto T, Sakuma T, Kaneko T, Tanaka M, Izawa T, Yamate J, Kuwamura M
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Journal Title
Exp. Anim.
Volume: 69
Issue: 1
Pages: 26-33
DOI
NAID
ISSN
1341-1357, 1881-7122
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Peer Reviewed / Open Access
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Author(s)
Sawada H, Yamamoto K, Yamaguchi A, Yamada L, Higuchi A, Nukaya H, Fukuoka M, Sakuma T, Yamamoto T, Sasakura Y, Shirae-Kurabayashi M
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 1-11
DOI
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[Journal Article] Anephrogenic phenotype induced by SALL1 gene knockout in pigs2019
Author(s)
Watanabe M, Nakano K, Uchikura A, Matsunari H, Yashima S, Umeyama K, Takayanagi S, Sakuma T, Yamamoto T, Morita S, Horii T, Hatada I, Nishinakamura R, Nakauchi H, Nagashima H.
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 8016-8016
DOI
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Higuchi K, Kazeto Y, Ozaki Y, Yamaguchi T, Shimada Y, Ina Y, Soma S, Sakakura Y, Goto R, Matsubara T, Nishiki I, Iwasaki Y, Yasuike M, Nakamura Y, Matsuura A, Masuma S, Sakuma T, Yamamoto T, Masaoka T, Kobayashi T, Fujiwara A, Gen K
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 13871-13871
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[Journal Article] Efficient genome engineering using Platinum TALEN in potato2019
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Yasumoto S, Umemoto N, Lee HJ, Nakayasu M, Sawai S, Sakuma T, Yamamoto T, Mizutani M, Saito K, Muranaka T
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Journal Title
Plant Biotechnology
Volume: 36
Issue: 3
Pages: 167-173
DOI
ISSN
1342-4580, 1347-6114
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