| Project/Area Number |
19K16350
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
橋本 洋佑 名古屋大学, 環境医学研究所, 学振特別研究員(PD) (60808252)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2020-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | Claudin-5 / Blood-brain barrier / Tight junction / 血液脳関門 |
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| Outline of Research at the Start |
血液脳関門は脳内へ薬物を送達する際の、文字通り関門として働く。その関門の役割をしているのが、脳内の血管内皮細胞の間隙に存在する密着結合である。この密着結合を緩め、血液脳関門の透過性を亢進させることにより、多量の薬物の送達が可能になるため、様々な方法が現在開発中である。しかし、その緩めた際に生じ得る副作用は、極端に血管に傷害を与えた場合を除き、理解されていない。本研究は、血液脳関門のの透過性の亢進度に、どの程度以下ならばクスリに応用でき、どの程度以上ならばリスクになる、という閾値は存在するのか？という問いを基底に置き、血液脳関門の透過性を微小亢進させた際の脳内微小環境の可視化を目的に研究を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、血液脳関門の透過性が亢進した際に生じる脳内の本質的理解を目的としている。その手段として、密着結合の構成本体であるclaudin-5に対するshRNA発現アデノ随伴ウイルスを脳内各所に投与した後の投与部位周辺の脳内細胞の遺伝子発現の変動を、ダイセクターを用いてヒートマップ形式で評価していくことを企画していた。
現在は、欧州の大学に留学している関係もあり、動物実験の実施許可を申し込み、必要なトレーニングを受けているが、修了するまで1年近い期間を要する。その間、in vivoでの実験の際にPCRを実施する遺伝子群の絞り込みをすることを目的に、in vitroの実験系によりclaudin-5の発現量を制御する遺伝子を網羅的に検出することを企画している。具体的には、Cas9/CRISPRシステムを用いてclaudin-5を発現している細胞の遺伝子をランダムに欠損させ、claudin-5の細胞表面量に基づいて細胞をフローサイトメトリーにより分離し、分離した細胞で発現しているguide RNAの配列情報からclaudin-5の発現量を正/負に制御している遺伝子群を同定していく。本系により実際に同定した遺伝子をノックダウンすることで、間接的にclaudin-5の発現を制御させることもできると期待される。本年度では、Sigma-Aldrich製のレンチウイルスによるgenome-wide screening kitの購入、同ウイルスを導入するためのブラストサイジン耐性を有するCas9/CRISPRを発現するマウス不死化血管内皮細胞株の作製、claudin-5の細胞外領域を認識する結合する分子の作製を行った。
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