Identification and conversion of machinery for fungal oleanane triterpenoids biosynthesis

• Project/Area Number: 19K16402
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 47050:Environmental and natural pharmaceutical resources-related
• Research Institution: Tokushima Bunri University
• Principal Investigator: 米山 達朗 徳島文理大学, 薬学部, 助教 (30825675)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2019: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: コルクタケ / β-アミリン / シーケンス解析 / シトクロムP450 / コフキサルノコシカケ / 真菌由来オレアナン型トリテルペン

Outline of Research at the Start

コフキサルノコシカケ Ganoderma applanatumはマンネンタケ科の担子菌であり、子実体にはオレアナン型トリテルペン類を含む事が知られている。この化合物群は多様な生物活性を示すが菌類からの単離報告は稀であり、生合成遺伝子に関する報告はない。
この事から本研究では、本菌の生合成遺伝子を探索しその同定・機能解析を行う事でオレアナン型トリテルペンを修飾する新たな生合成遺伝子の発見を目指す。
さらに得られた酵素群とこれまでに発見した関連酵素を組み合わせる事で新たな化合物群を創出し、薬用資源としての活用を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

徳島県内にて採取したコフキサルノコシカケと推定される野生子実体（きのこ）からの成分探索を行った。LC/MSを用いて本研究の目的化合物であるオレアナン誘導体（β-アミリンおよび推定される類縁化合物）の分子量を指標に成分探索を行うと、β-アミリン、β-アミリンから一段階の水酸化を受けたerythrodiolおよび複数回の酸化を受けたと思われる(20β)-3-Oxooleana-1,12-dien-29-oic acidおよび新規化合物の4種の化合物を単離した。これらは目的化合物の予想代謝経路における中間体化合物であり、子実体においてβ-アミリンの代謝反応が起こった、すなわち本研究の目的とする真菌由来の代謝酵素遺伝子の存在を強く示唆する新たな知見である。また、製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター（NBRC）より導入した5菌株のコフキサルノコシカケ Ganoderma applanatumについて培養を行いその代謝物を分析すると3菌株にβ-アミリンと一致する化合物を認めた。
これらの菌株を用いた遺伝子解析を行うため、野生子実体およびβ-アミリンを認めた3種のNBRC株について遺伝子を用いた鑑別を行うと、野生子実体はコルクタケ Phellinus torulosus、NBRC株はチリメンタケ等となり、我々の形態学的な鑑別の誤りが示唆されると共に導入した菌株が野生子実体とは別種である事が判明した。このため、さらに農業生物資源ジーンバンクからコルクタケ菌株を3種導入し、同様に鑑別を行ったがコルクタケとは異なる同種菌類であり目的の菌とは異なるという結果を得た。これらの結果から、遺伝子を用いた鑑別の分類学的な問題についても今後の課題となることが示唆された。
そのため今回、導入した菌株ではなく、野生子実体からゲノム情報の取得を開始するに至った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

遺伝子解析についてサンプルの準備のため遅れが生じている。分析対象とする種の菌株を得る事ができず、遺伝子解析を開始するまでに期間を必要とした。またサンプルのシーケンス解析の完了にも時間を要する。
しかしその間、成分探索では目的化合物の複数の予想中間体および新規化合物を得るなど今後の分析に必要な知見が得られた事からこの点については十分な成果が得られたと考えている。
また、遺伝子解析に必要な一核菌糸の調整法や鑑別法について準備を進めたため、今後さらに進展が得られると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本研究では初めに該当菌株のExpressed Sequence Tag (EST) データの取得を予定していたが、導入した菌株の使用が不適切であり目的酵素の発現条件の検討が行えなくなった事から、野生子実体より抽出したゲノムDNAを用いてそのシーケンス解析を行うこととした。今後はこの情報をもとにβ-アミリン生合成酵素およびβ-アミリンの代謝酵素の探索を行う。この際、遺伝子クラスターの有無についても検討し、効率的な探索を行う。
一方で、計画段階より子実体や二核菌糸から得られるゲノム情報の重複により解析が複雑になることが懸念されているが、これに対しては野生採取品の胞子からの一核菌糸の単離を行うことでコルクタケ菌株の獲得を目指す必要がある。得られた一核菌糸よりゲノム情報を取得し合わせて解析を行うことでより確実に目的酵素遺伝子が同定されると考えられる。
さらに、目的化合物であるβ-アミリンの類縁体探索についても継続して行うことで今後得られる酵素遺伝子候補の活性評価方法の確立や酵素機能予測に用いるとともに得られた化合物の生物活性の評価を行っていく。