Development of new in vitro phenotypic assay to detect the artemisinin resistant Plasmodium falciparum

• Project/Area Number: 19K16631
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 49040:Parasitology-related
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 池田 美恵 順天堂大学, 大学院医学研究科, 学振特別研究員(RPD) (40734314)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: アルテミシニン耐性 / マラリア原虫 / Pyknotic form / RSA / 原虫密度 / ヘマトクリット / アルテミシニン / in vitro 検査法 / ELISA / pyknotic form / Pyknotic / 熱帯熱マラリア原虫 / 薬剤耐性 / in vitro 解析 / pyknotic

Outline of Research at the Start

本研究では、流行地でも利用可能な新規アルテミシニン耐性検査法（qRSA)の開発を行う。特に、熱帯熱マラリア原虫では、アルテミシニンによってpyknoticとよばれる死原虫が出現する。しかし、pyknoticが耐性判定に及ぼす影響、特にしばしば混同される熱帯熱マラリア原虫の休眠体との違いいは統一された見解がない。そこで、Pyknoticの特徴をFACSを用いて明らかにする。
その後、培養株を用いたqRSAの開発を進める。FACSは流行地において実用することが困難であるため、解析法としてELISAによってマラリア生存原虫数を解析可能にする。そのため、最終的な検証をウガンダにおいて実施、有効性を確認する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、マラリア第一選択薬アルテミシニンへの耐性原虫検出法であるring-stage survival assay (RSA)法の解析方法を改良し、より簡便なin vitro耐性検査法を開発することを目的としている。
本研究開始時、RSAではアルテミシニンによって出現するpyknotic formと耐性の関連を疑っていた。これまでの解析によって、アルテミシニン耐性の有無とpyknotic formの出現頻度には相関がみられないこと、実験室での培養条件次第でpyknotic formの頻度が変わることが明らかになってきた。さらにウガンダにおいて実施したRSAの改良法であるqRSAを用いたアルテミシニン疫学調査の結果からも、サンプルのpyknotic form出現頻度は2014年頃とは変わらず、2022年サンプルのアルテミシニン耐性と感受性原虫間での頻度も大きな差は見られなかった。pyknotic formの出現頻度と耐性との関連は薄いと考えられ、pyknotic formの頻度を基に耐性の有無を判定することは困難であると結論付けた。
今年度新たに得た知見として、培養原虫を用いたpyknotic　formの出現条件が分かってきた。標準株である3D7を用い、5% ソルビトール溶液での同調培養を2回繰り返し、そこから96時間経過でほぼすべての原虫をpyknotic formにすることに成功した。原虫が同調していること、原虫密度が高いことが影響していると考えられる。また、前者に比べるとさらなる検討が必要ではあるが培養条件でのヘマトクリットを上昇させることもpyknotic form形成に貢献している可能性が高い。これまで安定的にpyknotic formを得ることは難しかったが、上記の培養法を用いることで安定的な解析可能となる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本年度ウガンダにおいて実施したRSAの改良法であるqRSAを用いたアルテミシニン疫学調査の結果から、ウガンダでのRSAサンプルのpyknotic　formの頻度は2014年頃とは変わっておらず、またkelch13変異を持つアルテミシニン耐性原虫と感受性原虫間にも大きな差は見られなかった。この結果は、以前の培養原虫での結果と同様であり、pyknotic formの出現頻度は耐性と直接関連する表現型ではないことを示唆した。
さらに新たな知見として、pyknotic formの出現には、培養状態での原虫密度または赤血球密度が影響する可能性が示唆された。実際にマラリア原虫を同調しながら原虫密度を増やしていことpyknotic formを生成することに成功した。これまで困難であった安定的なpyknotic form解析のための新たな手法となる。

Strategy for Future Research Activity

培養原虫を用いたpyknotic formの生成が可能となったため、この方法を用いてpyknoticの解析を行う。さらにウガンダでの疫学調査で実施するRSAの解析にmRNAを用いる計画である。pyknotic formの出現頻度はフィールドでの培養環境の影響で変化するため、DNAを用いた解析ではpyknotic formの影響を完全に除外することは難しい。そこで現地で実施したRSAサンプルを保存し、そこから抽出したmRNAでqPCRを行う。mRNAでの定量によってRSAの解析を容易にする。
また、pyknotic formとよく似た形態である休眠体(Dormant form)との差別化も解析上の重要な課題である。この差別化にもmRNAでの定量法が役立つ可能性がある。それについてウガンダサンプルを用いた検証を予定している。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Gulu University/St Mary's Hospital Lacor(ウガンダ)
• [Int'l Joint Research] St Mary's Hospital Lacor/Gulu University(ウガンダ)
• [Journal Article] Isolation of Mutants With Reduced Susceptibility to Piperaquine From a Mutator of the Rodent Malaria Parasite Plasmodium berghei. (2021)
  • Author(s): Ikeda M, Hirai M, Tachibana SI, Mori T, Mita T.
  • Journal Title: Front Cell Infect Microbiol. Volume: - Pages: 672691-672691
  • DOI: 10.3389/fcimb.2021.672691
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Evidence of Artemisinin-Resistant Malaria in Africa. (2021)
  • Author(s): Balikagala B, Fukuda N, Ikeda M, Katuro OT, Tachibana SI, Yamauchi M, Opio W, Emoto S, Anywar DA, Kimura E, Palacpac NMQ, Odongo-Aginya EI, Ogwang M, Horii T, Mita T.
  • Journal Title: N Engl J Med. Volume: 385 Issue: 13 Pages: 1163-71
  • DOI: 10.1056/nejmoa2101746
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Emergence of artemisinin-resistant Plasmodium falciparum with kelch13 C580Y mutations on the island of New Guinea (2020)
  • Author(s): Miotto Olivo、Sekihara Makoto、Tachibana Shin-Ichiro、Yamauchi Masato et al
  • Journal Title: PLOS Pathogens Volume: 16 Issue: 12 Pages: e1009133-e1009133
  • DOI: 10.1371/journal.ppat.1009133
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Recovery and stable persistence of chloroquine sensitivity in Plasmodium falciparum parasites after its discontinued use in Northern Uganda (2020)
  • Author(s): Balikagala Betty、Sakurai-Yatsushiro Miki、Hirai Makoto et al
  • Journal Title: Malaria Journal Volume: 19 Issue: 1 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1186/s12936-020-03157-0
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] ウガンダ北部における熱帯熱マラリア原虫アルテミシニン感受性調査 (2023)
  • Author(s): 池田美恵,吉田菜穂子,Betty Balikagala,平井誠,福田直到,Osbert Katuro,Dennis Anywar,Nirianne M.Q. Palacpac , Emmanuel Aginya ,木村栄作,堀井俊宏,美田敏宏
  • Organizer: 第92回日本寄生虫学会大会
• [Presentation] Efficacy of piperaquine drug in Gulu Northern Uganda (2023)
  • Author(s): Betty Balikagala,Naoko Yoshida, Mie Ikeda, Naoyuki Fukuda, Makoto Hirai, Denis AAnywar, Osbert T Katuro, Gerald Odong, Eisaku Kimura, Nirianne M Q Paracpac, Martin Ogwang, Emmanuel I Odongo-Aginya, Toshihiro Horii, Toshihiro Mita.
  • Organizer: 第92回日本寄生虫学会大会