| Project/Area Number |
19K17682
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 53030:Respiratory medicine-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
小川 卓範 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00836687)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2020-03-31
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| Project Status |
Discontinued (Fiscal Year 2019)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
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| Keywords | ダイレクトリプログラミング / 肺胞上皮細胞 / 再生 / 直接リプログラミング / 肺の再生 / 肺線維症 |
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| Outline of Research at the Start |
肺線維症は進行性の不可逆的肺障害であり、根治的治療として再生医療が注目されているが、実現化には至っていない。再生医療の新手法として、体細胞から幹細胞を経ることなく目的細胞を誘導する直接リプログラミング法が報告されている。当グループはマウスで直接リプログラミングによる肺上皮様細胞の誘導に成功し、誘導細胞のインフルエンザ感染マウスへの投与で、生存率が改善する結果を得た。本研究ではブレオマイシンを用いた肺線維症モデルマウスにおける直接リプログラミング誘導肺上皮様細胞投与の有効性の検討、また同モデルマウスにおける肺線維芽細胞を対象とした生体内直接リプログラミングによる肺上皮細胞の誘導を目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
AT2の発生・分化に必要と考えられる14転写因子を抽出し、これらをレトロウイルスを用いて線維芽細胞に導入後、血清含有培地にて2次元培養を行った。導入後、AT2の特異的マーカーであるSurfactant protein-C (SPC)の発現を指標に当初の14因子の中から不可欠と考えられる4因子を絞り込んだ。さらなる培養効率の上昇のため、特異的4因子を導入した線維芽細胞をmatrigelに包埋し、3次元培養を行った。さらに培地を血清培地から、肺上皮細胞の発生・維持に必要と考えられるFGF系、BMP経路、TGF-β経路、Wntシグナル伝達経路を厳密に制御するように調整した無血清培地に変更することでリプログラミング効率、培養効率を上昇させた。SPCをGFPで標識した遺伝子改変マウスから採取した胎児線維芽細胞(Mouse Embryonic Fibroblast；MEF)に同方法で遺伝子導入・培養を行うと導入3日後からGFP陽性の細胞が確認され、その後GFP陽性の細胞からなるオルガノイドが確認された。導入7-10日後にフローサイトメトリー(FCM)で全細胞の70%前後の細胞がGFP陽性となることを確認した。線維芽細胞を含む間葉系マーカーのThy1.2陰性、上皮系マーカーのEpcam陽性、GFP陽性の誘導AT2細胞をsortし、再度同様の培地で3次元培養を行った。誘導AT2オルガノイドは蛍光免疫染色で間葉系のマーカーであるvimentin陰性、上皮系のマーカーであるE-cadherin陽性、SPC陽性のオルガノイドの存在を確認した。電子顕微鏡画像ではAT2に特徴的なラメラ体の存在を確認した。RNAseqで、線維芽細胞、AT2オルガノイド、胎児肺、成獣肺と比較すると、誘導AT2オルガノイドは胎児肺と遺伝子発現が最も近いことがわかった。
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