| Project/Area Number |
19K17710
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Basic Section 53040:Nephrology-related
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
山村 智彦 神戸大学, 医学研究科, 助教 (30770242)
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| Project Period (FY) |
2024-01-17 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
Fiscal Year 2019: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | アルポート症候群 / Ｘ染色体不活化 / 重症化機序 / X染色体不活化解析 / レーザーキャプチャーマイクロダイセクション / X染色体不活化 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、X染色体連鎖型アルポート症候群女性患者の腎生検検体からレーザーキャプチャーマイクロダイセクションにて糸球体のみを単離し、ゲノムDNA、メッセンジャーRNA、蛋白発現の3段階全てにおけるX染色体不活化解析を行い、不活化の程度と臨床的重症度の相関を調べる。連続切片を用いた同一糸球体における一元的な不活化解析を行う他、我々が開発したultra-deep RNAシークエンス法を用いた詳細な解析を行うこと、すでに我々が保有する多数の患者の検体及び臨床データを利用することにより、これまで明らかにされていなかったX染色体不活化と女性XLAS患者の重症度の相関を解明する画期的研究である。
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| Outline of Annual Research Achievements |
まず、すでに保有するX染色体連鎖型アルポート症候群女性患者の血液から抽出したゲノムDNAを用いてX染色体不活化解析を施行した。先行研究から日本人女性 患者の末期腎不全到達年齢中央値である65歳よりも早い段階で末期腎不全に至った症例を13例抽出し解析を行った結果、明らかなX染色体不活化の偏りを認めた 症例は1例のみであった。結果として、少なくとも血液のX染色体不活化が疾患重症度と関与する可能性は極めて低いと判断された。 次に、腎生検により得られた切片から抽出したDNAおよびRNAにおける不活化解析を行う準備として、自施設にて過去に腎生検を行い保存されている検体(パラフィン切片)を用いて薄切切片からのDNAおよびRNA抽出量の確認を施行した。レーザーキャプチャーマイクロダイセクション(LMD)による糸球体の単離を行わない 状態で10um厚の切片全体(1×15mm程度)からのRNAおよびDNAの抽出量はそれぞれ200ng/切片および100ng/切片と解析に耐えうる量であることが判明した。一方 で、パラフィン切片中の糸球体の面積比率からはLMDを行うと解析に十分な量のDNAおよびRNAが回収できない可能性が考えられた。そこでパラフィン切片ではな く凍結切片を用いてRNAの抽出を行ったところ、単位面積あたり約6倍のRNAが回収できることを確認した。 今後はまず切片全体から抽出したDNAおよびRNAで不活化解析を行い、解析系ができることを確認した上で、LMDを用いて糸球体のみを単離し不活化解析を行う予定としている。また、平行して免疫染色による不活化解析も施行予定である。さらに、X染色体連鎖型Alport症候群の原因遺伝子であるCOL4A5を含めたRNA解析用疾患パネルを作成し、血液や腎臓など十分な量のRNAにおいて解析が可能であることを確認した。
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