Liquid biopsy法による新規副腎マーカーの開発

• Project/Area Number: 19K18603
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56030:Urology-related
• Research Institution: Hirosaki University
• Principal Investigator: 藤田 尚紀 弘前大学, 医学研究科, 講師 (00792318)
• Project Period (FY): 2021-03-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,160,000 (Direct Cost: ¥3,200,000、Indirect Cost: ¥960,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2019: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
• Keywords: 原発性アルドステロン症 / cfDNA / バイオマーカー / ヒアルロン酸 / 糖鎖 / Cell free DNA / Liquid biopsy / cell free DNA

Outline of Research at the Start

原発性アルドステロン症は治療抵抗性の高血圧患者の20％を占める。原発性アルドステロン症は外科的処置（腹腔鏡下手術）で治癒が期待できる二次性高血圧であるが、手術後も遷延する高血圧症が約半数に見られ、治療効果が十分とは言い難く、治療効果を正確に反映するバイオマーカーの確立が望まれている。本研究では、治療抵抗性や治療効果を反映する糖鎖構造やcell free DNA(cfDNA)を血液サンプルの網羅的解析から定量検出するLiquid biopsy法の確立を行う。更に摘出組織と比較することにより、Liquid biopsyのサロゲートマーカーとしての有用性を検証する。

Outline of Annual Research Achievements

原発性アルドステロン症（PA）は2次性高血圧の中で最も頻度の高い疾患である。副腎摘除術で治癒が期待できるが、術後も遷延する高血圧症が約半数に見られ、その予測因子は明らかになっていない。我々はこれまで、各泌尿器科疾患における糖鎖解析により、新規バイオマーカーの開発を世界に先駆け発表してきた。この基盤を活用し、PA患者におけるCell free DNA（cfDNA）を抽出し、PAに伴って変化する糖鎖や遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）の検出を行うことで、病状や治療抵抗性の分子機構を解明し、新規バイオマーカーを開発することを目的とする。2021年から副腎腫瘍患者の血液採取を開始し、順次解析を行っている。現在45名程度のsampleが集まり、血漿を分離、cfDNAを抽出する作業を行っている。抽出されたcfDNA総量は測定可能であることが確認された。PAに伴って変化する糖鎖や遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数の測定を進めている。また、我々はグリコサミノグリカンの一つであるヒアルロン酸の代謝に関して研究を行い、Transmenmbrane protein 2 (TMEM2)が細胞外ヒアルロン酸の代謝を担っていることを世界に先駆けて報告した。PAではヒアルロン酸合成酵素であるHAS2やヒアルロン酸分解酵素であるTMEM2の発現が共に低下しており、ヒアルロン酸代謝異常が発症に関与している可能性がある。この可能性を追求するため、手術摘出標本のFFPE切片を作製し検討を開始している。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

現在、45例程度のsampleが集まり、順調に解析が進んでいる。しかし、コロナ禍における世界的な試薬不足などにより、実験のペースはやや遅れている。その中でも、抽出されたcfDNAにおける総量は測定可能であることが確認された。さらに、PAに伴って変化する遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数の測定を進めている。また、手術摘出標本のFFPE切片の作製を進めている。

Strategy for Future Research Activity

抽出されたcfDNAにおける遺伝子変化（CYP11B2 gene polymorphism等）、血管石灰化に関与する因子（osteopontin, osteocalcin, Runx2, Msx2等）のコピー数をddPCRにて測定する。また、網羅的糖鎖解析装置によるPA患者の血清糖鎖プロファイリングを行い、PAに関与する糖鎖、術後高血圧症が改善しない群に特徴的な糖鎖変化を同定する。同定された糖鎖構造を認識するレクチンを用いて、手術標本によるアルドステロン産生腫瘍内の糖鎖構造発現を検討し、レクチンアレイ、レクチンによる免疫染色を用い、糖鎖構造変化の由来を検討する予定である。また、手術摘出標本のFFPE切片を作製し、hyaluronan-binding proteinによるヒアルロン酸の染色、抗HAS2抗体および抗TMEM2抗体による染色を行う。また、我々は全身の細胞でTMEM2がノックアウトされるコンディショナルノックアウトマウスを保有しているため、副腎を採取しフェノタイプを確認する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Significance of pelvic lymph node dissection during radical prostatectomy in high-risk prostate cancer patients receiving neoadjuvant chemohormonal therapy (2022)
  • Author(s): Hiromichi Iwamura, Shingo Hatakeyama, Takuma Narita, Yusuke Ozaki, Sakae Konishi, Hirotaka Horiguchi, Hirotake Kodama, Yuta Kojima, Naoki Fujita, Teppei Okamoto, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 9675-9675
  • DOI: 10.1038/s41598-022-13651-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Association of oxidative stress with erectile dysfunction in community-dwelling men and men on dialysis (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Masaki Momota, Mizuri Ishida, Takuro Iwane, Shingo Hatakeyama, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Kanemitsu Yamaya, Chikara Ohyama
  • Journal Title: The Aging Male Volume: 25 Issue: 1 Pages: 193-201
  • DOI: 10.1080/13685538.2022.2103113
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Risk score-based substratification improves surveillance costs after transurethral resection of bladder tumor in patients with primary high-risk non-muscle-invasive bladder cancer (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Shingo Hatakeyama, Masaki Momota, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Hayato Yamamoto, Hiroyuki Ito, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 13786-13786
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17973-8
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Utility of the Age Discrepancy between Frailty-Based Biological Age and Expected Life Age in Patients with Urological Cancers (2022)
  • Author(s): Kyo Togashi, Shingo Hatakeyama, Osamu Soma, Kazutaka Okita, Naoki Fujita, Toshikazu Tanaka, Daisuke Noro, Hirotaka Horiguchi, Nozomi Uemura, Takuro Iwane, Teppei Okamoto, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Cancers (Basel) Volume: 14 Issue: 24 Pages: 6229-6229
  • DOI: 10.3390/cancers14246229
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Relationships of low-grade systemic inflammation and nutritional status with erectile dysfunction severity in men on dialysis (2022)
  • Author(s): Naoki Fujita, Shingo Hatakeyama, Masaki Momota, Tomoko Hamaya, Yuki Tobisawa, Tohru Yoneyama, Teppei Okamoto, Hayato Yamamoto, Takahiro Yoneyama, Yasuhiro Hashimoto, Kazuaki Yoshikawa, Chikara Ohyama
  • Journal Title: Andrology Volume: 10 Issue: 8 Pages: 1548-1555
  • DOI: 10.1111/andr.13259
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Associations of impaired grip strength and gait function with the severity of erectile dysfunction in men undergoing dialysis: a cross-sectional study (2021)
  • Author(s): Fujita Naoki、Hatakeyama Shingo、Momota Masaki、Tobisawa Yuki、Yoneyama Tohru、Okamoto Teppei、Yamamoto Hayato、Yoneyama Takahiro、Hashimoto Yasuhiro、Yoshikawa Kazuaki、Ohyama Chikara
  • Journal Title: The Aging Male Volume: 25 Issue: 1 Pages: 1-7
  • DOI: 10.1080/13685538.2021.2016690
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The cell surface hyaluronidase TMEM2 is essential for systemic hyaluronan catabolism and turnover (2021)
  • Author(s): Tobisawa Yuki、Fujita Naoki、Yamamoto Hayato、Ohyama Chikara、Irie Fumitoshi、Yamaguchi Yu
  • Journal Title: Journal of Biological Chemistry Volume: 297 Issue: 5 Pages: 101281-101281
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2021.101281
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The effect of number of treatment cycles of platinum-based first-line chemotherapy on maximum radiological response in patients with advanced urothelial carcinoma (2021)
  • Author(s): Okita Kazutaka、Hatakeyama Shingo、Hagiwara Kazuhisa、Suzuki Yuichiro、Tanaka Toshikazu、Noro Daisuke、Tokui Noriko、Fujita Naoki、Konishi Sakae、Okamoto Teppei、Yoneyama Tohru、Yamamoto Hayato、Yoneyama Takahiro、Hashimoto Yasuhiro、Ohyama Chikara
  • Journal Title: Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations Volume: - Issue: 12 Pages: 832.e17-832.e23
  • DOI: 10.1016/j.urolonc.2021.03.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Relationship of frailty with treatment modality selection in patients with muscle-invasive bladder cancer (FRART-BC study) (2021)
  • Author(s): Iwamura Hiromichi、Hatakeyama Shingo、Momota Masaki、Kojima Yuta、Narita Takuma、Okamoto Teppei、Fujita Naoki、Hamano Itsuto、Togashi Kyou、Hamaya Tomoko、Yoneyama Tohru、Yamamoto Hayato、Yoneyama Takahiro、Hashimoto Yasuhiro、Ohyama Chikara
  • Journal Title: Translational Andrology and Urology Volume: 10 Issue: 3 Pages: 1143-1151
  • DOI: 10.21037/tau-20-1351
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Trends in the use of neoadjuvant chemotherapy and oncological outcomes for high‐risk upper tract urothelial carcinoma: a multicentre retrospective study (2021)
  • Author(s): Hamaya Tomoko、Hatakeyama Shingo、Tanaka Toshikazu、Kubota Yuka、Togashi Kyo、Hosogoe Shogo、Fujita Naoki、Kusaka Ayumu、Tokui Noriko、Okamoto Teppei、Yamamoto Hayato、Yoneyama Tohru、Yoneyama Takahiro、Hashimoto Yasuhiro、Ohyama Chikara
  • Journal Title: BJU International Volume: - Issue: 4 Pages: 468-476
  • DOI: 10.1111/bju.15346
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Oncologic and patient-reported outcomes after robot-assisted radical prostatectomy in men aged >75 years (2021)
  • Author(s): Togashi Kyo、Hatakeyama Shingo、Okamoto Teppei、Kojima Yuta、Iwamura Hiromichi、Fujita Naoki、Narita Takuma、Hamano Itsuto、Hamaya Tomoko、Yoneyama Tohru、Yamamoto Hayato、Yoneyama Takahiro、Hashimoto Yasuhiro、Ohyama Chikara
  • Journal Title: Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations Volume: - Issue: 10 Pages: 729.e17-729.e25
  • DOI: 10.1016/j.urolonc.2020.12.001
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Prognostic significance of the Ki67 index and programmed death-ligand 1 expression after radical cystectomy in patients with muscle-invasive bladder cancer (2021)
  • Author(s): Horiguchi Hirotaka、Hatakeyama Shingo、Yoneyama Tohru、Yoneyama Mihoko Sutoh、Tanaka Toshikazu、Fujita Naoki、Okamoto Teppei、Yamamoto Hayato、Yoneyama Takahiro、Yoshizawa Tadashi、Hashimoto Yasuhiro、Kawaguchi Toshiaki、Ohyama Chikara
  • Journal Title: Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations Volume: 39 Issue: 4 Pages: 238.e9-238.e17
  • DOI: 10.1016/j.urolonc.2020.11.029
  • Peer Reviewed / Open Access