角膜実質細胞の分化における小胞体ストレス応答の働き

• Project/Area Number: 19K18879
• Research Category: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 56060:Ophthalmology-related
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 宮城 秀考 広島大学, 病院(医), 病院助教 (80526210)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2021-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2020)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2020: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000); Fiscal Year 2019: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 角膜実質細胞 / 線維化 / 小胞体ストレス / 角膜線維芽細胞 / PERK / 筋線維芽細胞 / 創傷治癒

Outline of Research at the Start

角膜はその光学的特性により精緻なレンズ機能を有している。外傷や手術による侵襲により、角膜実質細胞の分化による線維化が過剰に生じることで、透明性低下や変形が起こり、視機能障害の原因となる。
申請者は予備実験で、細胞がストレスによる障害を回避し恒常性を保つために備えている小胞体ストレス応答と呼ばれる細胞内防御機構が、線維化の指標の一つであるα-smooth muscle actin （α-SMA）の発現に関与していることを示した。
今回の研究では角膜実質細胞を用い、角膜の創傷治癒に伴う角膜実質細胞の分化を小胞体ストレス応答経路が司っていることを明らかにし、角膜の線維化に対する新たな治療標的を探索する。

Outline of Annual Research Achievements

マウス胚線維芽細胞を2ng/ml TGF-βで刺激し筋線維芽細胞への分化を促すと、小胞体ストレスマーカーであるBiPやspliced XBP-1の遺伝子発現が誘導されることから、小胞体ストレスが起きていることが示唆された。また、小胞体ストレス応答経路の主要な３つのセンサータンパクであるPERK、IRE1、ATF6それぞれをノックアウト、またはノックダウンしたマウス胚線維芽細胞をTGF-βで刺激し、それぞれの筋線維芽細胞への分化をα-smooth muscle actinの遺伝子発現で評価すると、PERKをノックアウトしたマウス胚線維芽細胞においては発現が抑制された。以上のことから線維芽細胞から筋線維芽細胞への分化には小胞体ストレス応答経路の内、主にPERK経路が関わっていることが示唆された。並行して、野生型マウスの角膜を採取し、disc上で培養することでマウスの角膜実質細胞を分離培養する手技を確立した。また、ヒト強角膜片から角膜実質を切り出し、dish上で培養することで角膜実質から線維芽細胞を初代培養することに成功した。初代培養したヒト角膜実質細胞を様々な条件の器質上で培養するため、ヒト角膜の硬さを模した25ｋPa（正常角膜）と75ｋPa（線維化した角膜）のハイドロゲルを作成する手技を確立した。また、細胞培養可能になるようハイドロゲルの細胞毒性を無くす最適な洗浄法を決定した。その後、新型コロナウイルス感染症流行のため研究は中断していた。この度、研究代表者の異動により研究継続ができなくなったため廃止申請を行った。