膵癌オルガノイドを用いたpartialEMTによるクラスター浸潤機序の解明と制御

• Project/Area Number: 19K22663
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 55:Surgery of the organs maintaining homeostasis and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 中村 雅史 九州大学, 医学研究院, 教授 (30372741)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 寅田 信博 九州大学, 大学病院, 臨床検査技師 (00398075) ; 岩本 千佳 九州大学, 大学病院, 特任助教 (10752842) ; 藤田 逸人 九州大学, 医学研究院, 助教 (40611281) ; 森山 大樹 九州大学, 大学病院, 准教授 (70586859) ; 三好 圭 九州大学, 大学病院, 助教 (70755272)
• Project Period (FY): 2019-06-28 – 2021-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2019)
• Budget Amount: ¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2020: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000); Fiscal Year 2019: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
• Keywords: 膵癌 / オルガノイド / collective invasion / partial EMT / 膵星細胞 / エピジェネティック / 上皮間葉転換 / クラスター浸潤 / 微小環境

Outline of Research at the Start

EMTは癌の浸潤・転移に重要であるとされ、世界的に幅広く研究されているが、実際にはEMTでは説明できない転移、浸潤形式が多く存在する。最近ではEMT後にMETをきたす上皮可塑性が注目されており、これは癌細胞のみでの現象ではなく、癌細胞のエピジェニック調節の変化により起こりうると考えられる。しかしこれを検討した報告はない。癌における表現型可塑性の一端はエピゲノムが担っており、そのエピジェニック調節の変化は微小環境変化が影響していると考えられ、3次元共培養モデルを用いることで癌周囲微小環境の変化と癌細胞の表現型可塑性の関係解明が癌の浸潤・転移機序の解明に寄与し得る。

Outline of Annual Research Achievements

本研究はヒト膵癌オルガノイドを用いた共培養モデルを作成し、partial EMTによるクラスター浸潤機序の解明および制御を目的とする。当該年度は、ヒト膵癌組織を積極的に採取し、同一組織から膵癌オルガノイドおよび膵星細胞の樹立を行った。結果として、8症例の膵癌オルガノイドおよび膵星細胞を樹立できた。これら膵癌オルガノイドおよび膵星細胞を基底膜マトリックスおよび非接着性 U底wellを用いて遠心後に培養を行うといった独自の方法で3次元共培養モデルを作製した。それらをパラフィン固定後にH&E染色し形態学的評価を行った。さらにVimentin,αSMA, CK19を免疫組織学的染色で評価したところ、実際の膵癌組織の形態学的特徴を保持していることがわかった。さらに浸潤形態を観察するために、膵癌オルガノイドに蛍光タンパクであるGFPを、膵星細胞にRFPをtransfectionし、3次元共培養モデルをタイムラプスイメージングによってリアルタイムに観察した。すると、膵癌細胞同士が接着したまま浸潤するクラスター浸潤する様が観察・記録された。しかし、浸潤部位が本体から分離し、新たにオルガノイドを形成する様子は観察されなかった。もし、浸潤部位が本体から分離し、その後オルガノイドを形成すれば、EMT→METといった形態変化を再現できると考えられる。今後は、EMT⇒METを再現し、それらを蛍光免疫染色を用いてE-cadherin、Vimentin等を染色しその変化を検証する予定である。EMT⇒METを証明できれば、それら細胞集団はpartial EMTをきたしていると考えられ、それらを分取しエピジェネティック調節の変化を検討していきたい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当該年度に予定していた膵癌オルガノイドおよび膵星細胞の樹立と、それらを用いた微小環境再現モデルは作成できた。また、それらをタイムラプスイメージングを用いて浸潤形態を観察し、collective invasionを再現できた。

Strategy for Future Research Activity

今後は、EMT⇒METを再現し、それらを蛍光免疫染色を用いてE-cadherin、Vimentin等を染色しその変化を検証する予定である。EMT⇒METを証明できれば、それら細胞集団はpartial EMTをきたしていると考えられ、それらを分取しエピジェネティック調節の変化を検討していきたい。