| Project/Area Number |
19K23735
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
伊藤 優志 国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 特別研究員(PD) (20847206)
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| Project Period (FY) |
2019-08-30 – 2021-03-31
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| Project Status |
Discontinued (Fiscal Year 2020)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | ヌクレオソーム / クロマチン / 一分子蛍光イメージング / 蛍光顕微鏡 / 転写 / DNA複製 / オーキシン / 液液相分離 / RNA転写 / ヒト細胞 / 一分子蛍光顕微鏡 / イメージング |
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| Outline of Research at the Start |
本研究は、DNA複製の開始に必要なタンパク質である、ヒトのTreslinとTopBP1がDNAの複製開始を制御するメカニズムを解明する研究である。一分子蛍光顕微鏡を使用し、TreslinとTopBP1の細胞核内での動きを直接捉える。一分子イメージングを行うことで、これまでの遺伝学的・生化学的解析では知り得なかった、TreslinとTopBP1が機能する時空間的な「現場」を明らかにすることができる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
当該年度は、一分子蛍光顕微鏡を用いてヌクレオソームの動きを追跡した。具体的には、Haloタグを修飾したヒストンタンパク質H2Bを持つ細胞を作製し、その細胞に蛍光色素を加えることで、ヌクレオソーム一分子を蛍光で可視化した。
RNAの転写がヌクレオソームの運動に与える影響を検証するために、転写に関わるメディエータータンパク質複合体を分解した。初めに、ヒトHCT116細胞を使用し、オーキシンという薬剤に応答してメディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製した。その細胞を使用し、メディエータータンパク質の一つであるMED14を分解したところ、ヌクレオソームの動きがわずかに増加した。しかし、その増加幅は、転写阻害剤を使用した実験のものよりも小さかった。この結果から、クロマチンの架橋に対するメディエータータンパク質複合体の寄与は小さいということが示唆された。一方、HCT116細胞は、核のサイズに対して占める核小体の割合が大きいために、ヌクレオソームの動きの変化が小さかった可能性も考えられた。そのため、現在、別の細胞であるヒトDLD-1細胞を使用し、メディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製している。また、DLD-1細胞においても、転写阻害剤で細胞を処理したり、RNAポリメラーゼを分解したりすることで、転写が阻害されてヌクレオソームの動きが顕著に増加することを確認した。
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