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一分子蛍光イメージングを用いたヒトDNA複製開始因子の動態解明

Research Project

Project/Area Number 19K23735
Research Category

Grant-in-Aid for Research Activity Start-up

Allocation TypeMulti-year Fund
Review Section 0701:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research InstitutionNational Institute of Genetics

Principal Investigator

伊藤 優志  国立遺伝学研究所, 遺伝メカニズム研究系, 特別研究員(PD) (20847206)

Project Period (FY) 2019-08-30 – 2021-03-31
Project Status Discontinued (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2019: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Keywordsヌクレオソーム / クロマチン / 一分子蛍光イメージング / 蛍光顕微鏡 / 転写 / DNA複製 / オーキシン / 液液相分離 / RNA転写 / ヒト細胞 / 一分子蛍光顕微鏡 / イメージング
Outline of Research at the Start

本研究は、DNA複製の開始に必要なタンパク質である、ヒトのTreslinとTopBP1がDNAの複製開始を制御するメカニズムを解明する研究である。一分子蛍光顕微鏡を使用し、TreslinとTopBP1の細胞核内での動きを直接捉える。一分子イメージングを行うことで、これまでの遺伝学的・生化学的解析では知り得なかった、TreslinとTopBP1が機能する時空間的な「現場」を明らかにすることができる。

Outline of Annual Research Achievements

当該年度は、一分子蛍光顕微鏡を用いてヌクレオソームの動きを追跡した。具体的には、Haloタグを修飾したヒストンタンパク質H2Bを持つ細胞を作製し、その細胞に蛍光色素を加えることで、ヌクレオソーム一分子を蛍光で可視化した。
RNAの転写がヌクレオソームの運動に与える影響を検証するために、転写に関わるメディエータータンパク質複合体を分解した。初めに、ヒトHCT116細胞を使用し、オーキシンという薬剤に応答してメディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製した。その細胞を使用し、メディエータータンパク質の一つであるMED14を分解したところ、ヌクレオソームの動きがわずかに増加した。しかし、その増加幅は、転写阻害剤を使用した実験のものよりも小さかった。この結果から、クロマチンの架橋に対するメディエータータンパク質複合体の寄与は小さいということが示唆された。一方、HCT116細胞は、核のサイズに対して占める核小体の割合が大きいために、ヌクレオソームの動きの変化が小さかった可能性も考えられた。そのため、現在、別の細胞であるヒトDLD-1細胞を使用し、メディエータータンパク質を分解するシステムを持つ細胞を作製している。また、DLD-1細胞においても、転写阻害剤で細胞を処理したり、RNAポリメラーゼを分解したりすることで、転写が阻害されてヌクレオソームの動きが顕著に増加することを確認した。

Report

(2 results)
  • 2020 Annual Research Report
  • 2019 Research-status Report
  • Research Products

    (3 results)

All 2020 2019

All Journal Article (2 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 2 results) Presentation (1 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results)

  • [Journal Article] Fluid-like chromatin: Toward understanding the real chromatin organization present in the cell2020

    • Author(s)
      Maeshima Kazuhiro、Tamura Sachiko、Hansen Jeffrey C.、Itoh Yuji
    • Journal Title

      Current Opinion in Cell Biology

      Volume: 64 Pages: 77-89

    • DOI

      10.1016/j.ceb.2020.02.016

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Local Chromatin Motion and Transcription2020

    • Author(s)
      Babokhov Michael、Hibino Kayo、Itoh Yuji、Maeshima Kazuhiro
    • Journal Title

      Journal of Molecular Biology

      Volume: 432 Issue: 3 Pages: 694-700

    • DOI

      10.1016/j.jmb.2019.10.018

    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] RNAポリメラーゼIIにより制御されるクロマチンダイナミクス2019

    • Author(s)
      伊藤優志、Babokhov Michael、日比野佳代、前島一博
    • Organizer
      第57回日本生物物理学会年会
    • Related Report
      2019 Research-status Report
    • Int'l Joint Research

URL: 

Published: 2019-09-03   Modified: 2021-12-27  

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