正確な生体内ゲノム編集評価システムの開発

• Project/Area Number: 19KK0401
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (A))
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
• Research Institution: The University of Tokyo (2020-2023); Osaka University (2019)
• Principal Investigator: 吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
• Project Period (FY): 2020 – 2024
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥15,210,000 (Direct Cost: ¥11,700,000、Indirect Cost: ¥3,510,000)
• Keywords: CRISPR-Cas3 / オフターゲット解析 / 標的特異性 / ゲノム編集 / オフターゲット

Outline of Research at the Start

汎用性、安全性の高い高効率なゲノム編集ツールは、様々なライフサイエンス分野の基礎研究・応用研究両面に必要不可欠な技術である。最近確立したCRISPR-Cas3を新しいゲノム編集ツールとして社会実装するためには、安全性や効率などを正確に評価する必要がある。本研究では、CRISPR-Cas3独自の変異導入機構を解明し、正確な生体内ゲノム編集評価システムを開発することで、社会実装できる独自性の高いゲノム編集ツールとして確立する。

Outline of Annual Research Achievements

汎用性、安全性の高い高効率なゲノム編集ツールは、様々なライフサイエンス分野の基礎研究・応用研究両面に必要不可欠な技術である。国産ゲノム編集技術として開発したCRISPR-Cas3を社会実装できるゲノム編集ツールとして確立するためには、安全性や効率などを正確に評価する必要があるが、CRISPR-Cas3の標的特異性を正確に評価できる解析手法は確立されていない。本課題研究では、スイス連邦工科大学のJacob Corn教授らと共に、CRISPR-Cas3の生体内ゲノム編集における正確な評価システムの開発を目指している。
本年度は、2020年から2021年にスイス連邦工科大学に滞在してChip-seq技術を用いて樹立した新規オフターゲット検出法DISC 3-seqの検証を行った。実際にin silico解析でオフターゲット候補領域を含む複数領域を選択して検証した結果、DISC 3-seqでもミスマッチの少ない領域の検出が可能だった一方、配列に依存しない領域も検出されたことから、CRISPR-Cas3システムが標的配列以外の領域に影響しうることが観察された。現在、DISC 3-seqのみで検出された領域についての変異導入効率を検討しており、今後細胞に加えて生体内での効果を詳細に検討することで、CRISPR-Cas3システムのゲノム編集効果を詳細に評価したい。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究では、DNA修復因子を利用したin vivoゲノム編集評価法を開発し、CRISPR-Cas3が汎用性および安全性の高いゲノム編集ツールであることを実証することである。本年度ヒト培養細胞を用いて、DNA修復関連因子Mre11に対する抗体を用いたChip-seqを行いそのピークを検出する方法をDISC 3-seqとして確立した。DISC 3-seqで検出された領域についてin silico解析で得られた領域との相関を評価した結果、少ないミスマッチ領域の検出ができる一方、配列に依存しない領域も検出されたため、これが検出エラーなのか実際の標的非特異的ゲノム編集によるものか、の検証が必要となった。そのため、2024年3-4月にスイス連邦工科大学に滞在して再度検証実験を行い、結果について議論を重ねているが、実証研究に遅れが生じている。次年度への計画延長を申請済みであり、最終的に、正確なオン・オフターゲット検出法として利用可能かを検証し、具体的な数値としてオフターゲット効果を算出する方法の確立を目指す。

Strategy for Future Research Activity

異なる標的配列、特にオフターゲットが生じる可能性が高い標的を念頭に、継続したChip-seq解析を行うとともにDISC 3-seqのみで検出された領域についての変異導入効率を検討し、全ゲノム中でのオンおよびオフターゲットへの効果を検討する。最終的には、得られた結果をin silico解析ツールに落とし込むことで、新しいオフターゲット予測プログラムを開発し、世界中のユーザーが利用可能なwebツール化を目指す。またin vivoゲノム編集時のオフターゲット評価を行うため、CRISPR-Cas3導入マウス、ラットを作製しており、現在機能解析中である。最終的にin vivoでのゲノム編集効率、オフターゲット効果を検討することで、遺伝子治療に向けて有用なツールであることを示す。

Research Products

• [Journal Article] A novel Kit mutant rat enables hematopoietic stem cell engraftment without irradiation (2024)
  • Author(s): Iida Ryuya、Ishida Saeko、Wang Jinxi、Hattori Kosuke、Yoshimi Kazuto、Yamazaki Satoshi、Mashimo Tomoji
  • Journal Title: Experimental Hematology Volume: 132 Pages: 104174-104174
  • DOI: 10.1016/j.exphem.2024.104174
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] <i>Cyba</i> and <i>Nox2</i> mutant rats show different incidences of eosinophilia in the genetic background- and sex-dependent manner (2023)
  • Author(s): MORI Masayuki、DAI Jian、MIYAHARA Hiroki、LI Ying、KANG Xiaojing、YOSHIMI Kazuto、MASHIMO Tomoji、HIGUCHI Keiichi、MATSUMOTO Kiyoshi
  • Journal Title: Experimental Animals Volume: 72 Issue: 2 Pages: 233-241
  • DOI: 10.1538/expanim.22-0122
  • ISSN: 0007-5124, 1341-1357, 1881-7122
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 【遺伝を考える】(III章)遺伝子操作とゲノム医療 CRISPR-Casシステム ゲノム編集と医療への応用 (2023)
  • Author(s): 吉見一人，真下知士
  • Journal Title: 日本医師会雑誌 Volume: 0 Pages: 194-197
• [Journal Article] タイプI CRISPRを用いたゲノム編集技術 (2023)
  • Author(s): 吉見一人
  • Journal Title: 生化学 Volume: 0 Pages: 818-822
• [Journal Article] ゲノム編集を用いた遺伝子改変マウス・ラットの作製 (2023)
  • Author(s): 吉見一人，真下知士
  • Journal Title: 実験医学別冊 改訂 マウス・ラット実験ノート Volume: - Pages: 160-170
• [Journal Article] 便利なデータベース紹介とその使用法 (2023)
  • Author(s): 吉見一人，真下知士
  • Journal Title: 実験医学別冊 改訂 マウス・ラット実験ノート Volume: - Pages: 171-179
• [Journal Article] 便利な受託機関紹介とその使用法 (2023)
  • Author(s): 吉見一人，真下知士
  • Journal Title: 実験医学別冊 改訂 マウス・ラット実験ノート Volume: - Pages: 180-187
• [Journal Article] 胚や精子の超低温保存法 (2023)
  • Author(s): 滝澤明子，小林俊寛，吉見一人
  • Journal Title: 実験医学別冊 改訂 マウス・ラット実験ノート Volume: - Pages: 59-67
• [Journal Article] 体外受精と胚移植 (2023)
  • Author(s): 小林俊寛，吉見一人
  • Journal Title: 実験医学別冊 改訂 マウス・ラット実験ノート Volume: - Pages: 68-73
• [Journal Article] CRISPR-Cas3システムによるゲノム編集－国産ゲノム編集技術の再生医療への挑戦 (2023)
  • Author(s): 渡辺祥司、吉見一人、真下知士
  • Journal Title: 実験医学 増刊 再生医療2023 Volume: 41 Pages: 193-199
• [Journal Article] Genome editing technology and applications with the type I CRISPR system, (2022)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi, Tomoji Mashimo
  • Journal Title: Gene and Genome Editing Volume: 3-4 Pages: 100013-100013
  • DOI: 10.1016/j.ggedit.2022.100013
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A heterozygous LAMA5 variant may contribute to slowly progressive, vinculin-enhanced familial FSGS and pulmonary defects. (2022)
  • Author(s): Kaimori JY, Kikkawa Y, Motooka D, Namba-Hamano T, Takuwa A, Okazaki A, Kobayashi K, Tanigawa A, Kotani Y, Uno Y, Yoshimi K, Hattori K, Asahina Y, Kajimoto S, Doi Y, Oka T, Sakaguchi Y, Mashimo T, Sekiguchi K, Nakaya A, Nomizu M, Isaka Y.
  • Journal Title: JCI insight Volume: 7 Issue: 23 Pages: 522-524
  • DOI: 10.1172/jci.insight.158378
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Dynamic mechanisms of CRISPR interference by Escherichia coli CRISPR-Cas3 (2022)
  • Author(s): Yoshimi Kazuto、Takeshita Kohei、Kodera Noriyuki、Shibumura Satomi、Yamauchi Yuko、Omatsu Mine、Umeda Kenichi、Kunihiro Yayoi、Yamamoto Masaki、Mashimo Tomoji
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 13 Issue: 1 Pages: 4917-4917
  • DOI: 10.1038/s41467-022-32618-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A high-quality severe combined immunodeficiency (SCID) rat bioresource. (2022)
  • Author(s): Yoshiki Miyasaka, Jinxi Wang, Kosuke Hattori, Yuko Yamauchi, Miho Hoshi, Kazuto Yoshimi, Saeko Ishida, Tomoji Mashimo,
  • Journal Title: PloS one Volume: 17 Issue: 8 Pages: e0272950-e0272950
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0272950
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The role of cell-autonomous circadian oscillation of Cry transcription in circadian rhythm generation (2022)
  • Author(s): Matsumura Ritsuko、Yoshimi Kazuto、Sawai Yuka、Yasumune Nanami、Kajihara Kohhei、Maejima Tatsuya、Koide Tsuyoshi、Node Koichi、Akashi Makoto
  • Journal Title: Cell Reports Volume: 39 Issue: 3 Pages: 110703-110703
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2022.110703
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3：遺伝子治療、診断への応用 (2022)
  • Author(s): 吉見一人
  • Journal Title: 再生医療 Volume: 21 Pages: 22-25
• [Journal Article] Study of the CRISPR/Cas3 System for Xenotransplantation (2022)
  • Author(s): Miyagawa S, Watanabe M, Nagashima H, Sato K, Kogata S, Toyama C, Masahata K, Kamiyama M, Yamamoto R, Eguchi H, Maeda A, Yoshimi K, Mashimo T, Okuyama H.
  • Journal Title: Transplant Proc Volume: 54 Issue: 2 Pages: 522-524
  • DOI: 10.1016/j.transproceed.2021.09.070
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and influenza virus (2022)
  • Author(s): Yoshimi K, Takeshita K, Yamayoshi S, Shibumura S, Yamauchi Y, Yamamoto M, Yotsuyanagi H, Kawaoka Y, Mashimo T.
  • Journal Title: iScience Volume: 25 Issue: 2 Pages: 103830-103830
  • DOI: 10.1016/j.isci.2022.103830
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Next-generation prebiotic promotes selective growth of bifidobacteria, suppressing Clostridioides difficile (2021)
  • Author(s): Hirano R., Sakanaka M., Yoshimi K., Sugimoto N., Eguchi S., Yamauchi Y., Nara M., Maeda S., Ami Y., Gotoh A., Katayama T., Iida N., Kato T., Ohno H., Fukiya S., Yokota A., Nishimoto M., Kitaoka M., Nakai H., Kurihara S.
  • Journal Title: Gut microbes Volume: 13 Issue: 1 Pages: 1973835-1973835
  • DOI: 10.1080/19490976.2021.1973835
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 新興感染症検査技術の進化 CRISPRを用いたCOVID-19迅速診断法 (2021)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Journal Title: 公衆衛生 Volume: 85 Pages: 746-750
• [Journal Article] CRISPR技術を用いた核酸検出 (2021)
  • Author(s): 吉見 一人, 真下 知士
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 39 Pages: 1214-1218
• [Journal Article] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3の特徴とCRISPR診断への応用 (2021)
  • Author(s): 吉見 一人, 真下 知士
  • Journal Title: 最新のゲノム編集技術と用途展開 Volume: 0 Pages: 51-58
• [Journal Article] Dynamic mechanisms of CRISPR interference by Escherichia coli CRISPR-Cas3 (2021)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi, Kohei Takeshita, Noriyuki Kodera, Satomi Shibumura, Yuko Yamauchi, Mine Omatsu, Yayoi Kunihiro, Masaki Yamamoto, Tomoji Mashimo
  • Journal Title: bioRxiv Volume: 0 Pages: 0-0
  • DOI: 10.1101/2021.07.18.452824
• [Journal Article] Chemokine ligand 28 (CCL28) negatively regulates trabecular bone mass by suppressing osteoblast and osteoclast activities (2021)
  • Author(s): Iwamoto Rina、Takahashi Takumi、Yoshimi Kazuto、Imai Yuji、Koide Tsuyoshi、Hara Miroku、Ninomiya Tadashi、Nakamura Hiroaki、Sayama Kazutoshi、Yukita Akira
  • Journal Title: Journal of Bone and Mineral Metabolism Volume: - Issue: 4 Pages: 558-571
  • DOI: 10.1007/s00774-021-01210-9
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ゲノム編集技術CRISPR-Cas3とそのCAR-T細胞療法への応用 (2021)
  • Author(s): 藤井智明、吉見一人、真下知士
  • Journal Title: バイオエクス・プレス 2021 冬 Volume: - Pages: 28-32
• [Journal Article] Photoactivatable Cre knock-in mice for spatiotemporal control of genetic engineering in vivo (2020)
  • Author(s): Yoshimi Kazuto、Yamauchi Yuko、Tanaka Takao、Shimada Toshio、Sato Moritoshi、Mashimo Tomoji
  • Journal Title: Laboratory Investigation Volume: 101 Issue: 1 Pages: 125-135
  • DOI: 10.1038/s41374-020-00482-5
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Combi-CRISPR: combination of NHEJ and HDR provides efficient and precise plasmid-based knock-ins in mice and rats (2020)
  • Author(s): Yoshimi K, Oka Y, Miyasaka Y, Kotani Y, Yasumura M, Uno Y, Hattori K, Tanigawa A, Sato M, Oya M, Nakamura K, Matsushita N, Kobayashi K, Mashimo T
  • Journal Title: Hum Genet Volume: 140 Issue: 2 Pages: 277-287
  • DOI: 10.1007/s00439-020-02198-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ゲノム編集技術CRISPR-Cas3とその遺伝子治療および診断への応用 (2020)
  • Author(s): 藤井 智明, 吉見 一人, 真下 知士
  • Journal Title: 実験医学（増刊）新規の創薬モダリティ Volume: 38(17) Pages: 2841-2846
• [Journal Article] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3の開発 (2020)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Journal Title: 遺伝子医学 Volume: 10(4) Pages: 16-21
• [Journal Article] 新規ゲノム編集ツールCRISPR-Cas3 (2020)
  • Author(s): 吉見 一人, 真下 知士
  • Journal Title: Precision Medicine Volume: 3(6) Pages: 512-515
• [Journal Article] CRISPR-Cas3を用いた新しいゲノム編集 (2020)
  • Author(s): 吉見 一人, 真下 知士
  • Journal Title: 医学のあゆみ Volume: 273(9) Pages: 751-755
• [Presentation] CRISPR-Casシステムを用いたマウス・ラットのゲノム編集 (2023)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Organizer: 第８回日本ゲノム編集学会
  • Invited
• [Presentation] Molecular mechanism of type I-E CRISPR-Cas3 mediated DNA breaks and its application to genome editing in zygotes (2023)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi, Kohei Takeshita, Noriyuki Kodera, Yamauchi Yuko, Kosuke Hattori, Taniguchi Hiromi, Yamamoto Masaki, Mashimo Tomoji
  • Organizer: Genome Engineering: CRISPR Frontiers 2023 at Cold Spring Harbor Laboratory?
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Development of a novel genome editing tool, Type I-E CRISPR, and its application in experimental animals (2023)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi
  • Organizer: 9th Asian Federation of Laboratory Animal Science Associations Congress 2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Genome editing technology and applications with the type I-E CRISPR system (2023)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi
  • Organizer: JAACT 2023
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] CRISPR-Cas3とは何者？どのようにして使えるのか？ (2023)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会バイオテクノロジーセミナー
  • Invited
• [Presentation] Type I CRISPR-Cas3システムを用いたゲノム編集技術 (2023)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
  • Invited
• [Presentation] Mechanisms of CRISPR-Cas3 mediated DNA breaks and its application for genome editing in embryos (2023)
  • Author(s): Yoshimi Kazuto, Takeshita Kohei, Noriyuki Kodera, Yamauchi Yuko, Hattori Kosuke, Yamamoto Masaki, Mashimo Tomoji
  • Organizer: the 36th IMGC 2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ゲノム編集による遺伝子改変ラットの作製 (2023)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Organizer: 第1６回ラットリソースリサーチ研究会
  • Invited
• [Presentation] Genome editing technology and applications with the type I-E CRISPR-Cas3 system (2022)
  • Author(s): Kazuto Yoshimi
  • Organizer: 熊本大学リエゾンラボ研究会／HIGOプログラム最先端研究セミナー
  • Invited
• [Presentation] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3の開発と医療分野への応用 (2022)
  • Author(s): 吉見 一人
  • Organizer: 東北大学 Neuropathy Management Web Seminar
  • Invited
• [Presentation] タイプI-E CRISPR-Cas3による標的二本鎖DNA切断機構の解明 (2022)
  • Author(s): 吉見 一人, 竹下 浩平, 古寺 哲幸, 渋村 里美, 山内 祐子, 山本 雅貴, 真下知士
  • Organizer: 日本ゲノム編集学会第7回大会
• [Presentation] CRISPR-Cas3によるDNA切断機構の解析および核酸検出への応用 (2021)
  • Author(s): 吉見 一人、竹下 浩平、古寺 哲幸、渋村 里美、山内 祐子、谷口 ひろみ、山本 雅貴、真下 知士
  • Organizer: 第 44 回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Development and applications of CRISPR-Cas3 technology for studying human diseases (2021)
  • Author(s): 吉見一人
  • Organizer: 第85回日本循環器学会学術集会
  • Invited
• [Presentation] 国産ゲノム編集技術CRISPR-Cas3の開発と応用 (2021)
  • Author(s): 吉見一人
  • Organizer: 第14回ラットリソースリサーチ研究会
  • Invited
• [Presentation] 国産ゲノム編集技術の開発と新型コロナウイルス診断への応用 (2020)
  • Author(s): 吉見一人
  • Organizer: 令和2年度第2回応用動物科学セミナー
  • Invited
• [Presentation] NBRP-免疫不全ラットと支援プラットフォームの概要 (2020)
  • Author(s): 服部 晃佑、 山内祐子、星 美穂、Jinxi Wang、吉見一人、真下知士
  • Organizer: 第43回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ゲノム編集技術CRISPR-Cas3とそのCAR-T細胞療法への応用 (2020)
  • Author(s): 藤井智明、吉見一人、玉田耕治、真下知士
  • Organizer: 第20回東京大学生命科学シンポジウム
• [Patent(Industrial Property Rights)] 改良されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システム (2024)
  • Inventor(s): 雑賀啓明、真下知士、吉見一人、村中俊哉、安本周平
  • Industrial Property Rights Holder: 雑賀啓明、真下知士、吉見一人、村中俊哉、安本周平
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2024-042105
  • Filing Date: 2024
• [Patent(Industrial Property Rights)] ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、標的ＤＮＡを編集する方法、標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法、標的ＤＮＡを検出する方法、及びキット (2024)
  • Inventor(s): 真下知士、吉見一人、阿部洋、阿部奈保子
  • Industrial Property Rights Holder: 真下知士、吉見一人、阿部洋、阿部奈保子
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2024-047341
  • Filing Date: 2024
• [Patent(Industrial Property Rights)] 試料中の特定のDNAを検出する方法 (2021)
  • Inventor(s): 真下知士、吉見一人、渋村里美
  • Industrial Property Rights Holder: 真下知士、吉見一人、渋村里美
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2021
  • Acquisition Date: 2021
• [Patent(Industrial Property Rights)] Ｃａｓ３タンパク質を製造する方法 (2021)
  • Inventor(s): 真下知士、吉見一人、竹下浩平、山本雅貴、渋村里美
  • Industrial Property Rights Holder: 真下知士、吉見一人、竹下浩平、山本雅貴、渋村里美
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-031907
  • Filing Date: 2021
• [Patent(Industrial Property Rights)] 試料中の特定のＤＮＡを検出する方法 (2021)
  • Inventor(s): 真下知士、吉見一人、渋村里美
  • Industrial Property Rights Holder: 真下知士、吉見一人、渋村里美
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2021
  • Overseas