可逆的光活性化蛍光蛋白質Dronpaを用いた細胞内アクチン動態のリアルタイム計測

• Project/Area Number: 20034002
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: Tohoku University
• Principal Investigator: 大橋 一正 Tohoku University, 大学院・生命科学研究科, 准教授 (10312539)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥2,900,000 (Direct Cost: ¥2,900,000); Fiscal Year 2009: ¥1,500,000 (Direct Cost: ¥1,500,000); Fiscal Year 2008: ¥1,400,000 (Direct Cost: ¥1,400,000)
• Keywords: アクチン骨格 / Dronpa / イメージング / 細胞運動 / シグナル伝達 / DronDa

Research Abstract

本研究課題により、アクチン骨格を構成する単量体アクチンの生細胞内における濃度測定の方法を開発し、さらに、任意の局所におけるアクチン濃度の経時変化を測定する方法を開発することに成功した。可逆的光活性化蛍光蛋白質であるDronpaを融合したアクチンを細胞に発現させ、全体を励起光による退色後、局所のDronpaを光活性化し、その拡散による蛍光減衰曲線から重合したアクチンと拡散する単分子の成分を分離して抽出することで単量体アクチンの濃度を算出するものである。これを連続して行うことで濃度の経時変化を追うことも可能となった。この方法を用いて、細胞運動における単量体アクチン濃度の変化を解析し、細胞が静的状態から刺激依存的な運動を引き起こす際に、細胞内の単量体アクチンを4割程度重合していることが明らかとなった。また、運動時のアクチン重合とアクチン骨格による仮足形成により複雑な過程があることを示唆する結果を得た。さらに、任意の部位における単量体アクチンの濃度変化を測定した結果、細胞内における単量体アクチンの拡散は早く、細胞移動時の前方や後方において単量体アクチンの濃度に有為な差がないことが明らかとなった。本研究で開発した方法は、単量体の分子の濃度の測定に限らず、細胞膜や細胞骨格に結合した分子の量や結合と解離の速度の変化を測定することができる方法であることが示唆された。細胞内の多くの蛋白質は流動的に局在を変化させ、標的となる部位への局在と離脱を繰り返している。本研究によって開発された解析方法はこのような細胞内分子の時空間的制御の解析に有効であると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] LIM-kinase is critical for the mesenchymal-to-amoeboid cell morphological transition in 3D matrices (2010)
  • Author(s): Mishima T., et al.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. 392 Pages: 577-581
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV-mediated LIM-kinase activation is critical for calcium signal-induced neurite outgrowth (2009)
  • Author(s): Takemura M., et al.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 284 Pages: 28554-28562
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular dissection of the mechanisms of substrate recognition and F-actin-mediated activation of cofilin-phosphatase Slingshot-1 (2009)
  • Author(s): Chiba S, et.al.
  • Journal Title: Current Biology 19 Pages: 1-7
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular dissection of the mechanisms of substrate recognition and F-actin-mediated activation of cofilin-phosphatase Slingshot-1 (2008)
  • Author(s): Kurita S, et.al.
  • Journal Title: J. Biol. Chem 283 Pages: 32542-32552
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Critical roles of actin-interacting protein 1 in cytokinesis and chemotactic migration of mammalian cells (2008)
  • Author(s): Kato A, et.al.
  • Journal Title: Biochemical J 414 Pages: 261-270
  • Peer Reviewed
• [Presentation] High-throughput screening for low-molecular weight inhibitors of protein-protein interactions using BiFC probes (2009)
  • Author(s): 東海林和康, 他
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2009-12-11
• [Presentation] Identification of filamin A as the Slingshot-binding protein (2009)
  • Author(s): 佐上彩, 他
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] A critical role of LIM-kinase in Mesenchymal-amoeboid trasition of cancer cell migration (2009)
  • Author(s): 三嶋利明, 他
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2009-12-10
• [Presentation] Mitotic activation of NDR1 kinase and its role in chromosome alignment (2009)
  • Author(s): 池田真教, 他
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2009-12-09
• [Presentation] NDRキナーゼの活性制御機構と染色体整列における機能 (2009)
  • Author(s): 水野健作, 他
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場(神戸)
  • Year and Date: 2009-10-24
• [Presentation] Wnt-PCP経路によるRhoA活性化と神経突起退縮に関与するRho-GEFの同定 (2009)
  • Author(s): 辻拓史, 他
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場(神戸)
  • Year and Date: 2009-10-24
• [Presentation] コフィリンホスファターゼ Slingshot の活性制御機構と細胞遊走、細胞分裂における機能 (2009)
  • Author(s): 大橋一正、水野健作
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場(神戸)
  • Year and Date: 2009-10-23
• [Presentation] 生細胞内アクチンモノマー濃度変化測定のためのFDAPタイムラプスイメージング法の開発とラメリポディア形成過程におけるコフィリン、アクチンモノマーの重要性 (2009)
  • Author(s): 永井友朗, 他
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸国際会議場(神戸)
  • Year and Date: 2009-10-22
• [Presentation] 新規LIMキナーゼ阻害剤の癌細胞の移動、浸潤に対する効果 (2009)
  • Author(s): 大橋一正、水野健作
  • Organizer: 第68回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(横浜)
  • Year and Date: 2009-10-03
• [Presentation] Role of cofilin phosphorylation in BDNF-induced dendritogenesis (2009)
  • Author(s): 大橋一正, 他
  • Organizer: 第52回日本神経化学会大会
  • Place of Presentation: ホテル天坊(伊香保)
  • Year and Date: 2009-06-23
• [Presentation] NDRキナーゼの活性化制御機構と分裂期染色体整列における機能 (2009)
  • Author(s): 千葉秀平, 他
  • Organizer: 第61回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 名古屋国際会議場(名古屋)
  • Year and Date: 2009-06-04
• [Presentation] Analysis of the regulation of actin cytoskeleton dynamics using Dronpa , a photochromic fluorescent protein (2008)
  • Author(s): 辻拓史, 他
  • Organizer: 日本生化学会東北支部例会
  • Place of Presentation: 盛岡
  • Year and Date: 2008-05-17
• [Presentation] Roles of cofilin phospho-regulation in tumor cell migration and invasion (2008)
  • Author(s): 大橋一正, 他
  • Organizer: 第60回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] Phosohorylation of Slingshot-1 by Polo-like kinase-1 (2008)
  • Author(s): 大槻美樹, 他
  • Organizer: 第60回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] Involvement of cofilin/ADF, Slingshot and LIM-kinase in invadopodium formation of tumor cells (2008)
  • Author(s): 北谷佳奈恵, 他
  • Organizer: 第60回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] Identification of Rho-GEFs that mediate Dishevelled-induced RhoA activ ation (2008)
  • Author(s): 辻拓史, 他
  • Organizer: 第60回日本細胞生物学会大会
  • Place of Presentation: 横浜
• [Presentation] Roles of cofilin phosphorylation in neurite outgrowth and dendritogenesis (2008)
  • Author(s): 大橋一正, 他
  • Organizer: 第31回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] LIM-kinase is required for BDNF-induced dendritogenesis (2008)
  • Author(s): 宮島健, 他
  • Organizer: 第31回日本神経科学大会
  • Place of Presentation: 東京
• [Presentation] Cofilin phospho-regulation plays a critical role in tumor cell motility and invasion (2008)
  • Author(s): 大橋一正, 他
  • Organizer: 第67回日本癌学会学術総会
  • Place of Presentation: 名古屋
• [Presentation] Analysis of the regulation of actin cytoskeleton dynamics using Dronpa , a photochromic fluorescent protein (2008)
  • Author(s): 大橋一正, 他
  • Organizer: 2008 International Symposium on Micro-NanoMechatr onics and Human Science
  • Place of Presentation: 名古屋
• [Presentation] MST2, MST3によるNDR1の活性制御と細胞分裂の制御 (2008)
  • Author(s): 池田真教, 他
  • Organizer: BMB2008第81回日本生化学会大会・第31回日本分子生物学会年会・合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] 哺乳類細胞の対称分裂における紡錘体位置決定タンパク質の局在とアクチン骨格の関与 (2008)
  • Author(s): 林文, 他
  • Organizer: BMB2008第81回日本生化学会大会・第31回日本分子生物学会年会・合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] ラメリポディア形成過程における細胞内G-アクチン濃度のタイムラプスイメージング-Dronpa-アクチンのFDAP解析を用いて- (2008)
  • Author(s): 永井友朗, 他
  • Organizer: BMB2008第81回日本生化学会大会・第31回日本分子生物学会年会・合同大会
  • Place of Presentation: 神戸
• [Presentation] Phosphorylation of Slingshot-1 by Polo-like kinase-1 (2008)
  • Author(s): 大槻美樹, 他
  • Organizer: The 48th Annual Meeting of The American Society for Cell Biology
  • Place of Presentation: サンフランシスコ(米国)
• [Remarks]
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/biomolecular/ts_oohashi.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.lifesci.tohoku.ac.jp/teacher/biomolecular/ts_oohashi.html