人工細胞モデル構築のための基盤技術としての無細胞タンパク質合成システムの構築

• Project/Area Number: 20034009
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Science and Engineering
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 清水 義宏 The University of Tokyo, 大学院・新領域創成科学研究科, 助教 (90401231)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000); Fiscal Year 2009: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2008: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000)
• Keywords: リボソーム / tRNA / 翻訳 / 無細胞タンパク質合成 / Synthetic biology

Research Abstract

リボソーム再構成系の高効率化の検討及び、転写調製したtRNAを用いた無細胞タンパク質合成システムの構築の二点を実施した。一点目については、リボソームの試験管内再構成とポリ(U)依存的ポリフェニルアラニン合成を同時に行うシステムを立ち上げ、リボソームの再構成の効率を測定する系を構築した。このシステムにおいてはリボソームの再構成とタンパク質合成を連動させる必要があるため、従来のリボソーム試験管内再構成系と異なり、系内の塩濃度を生体内と同様に低めに保つ必要がある。その結果、リボソームの再構成効率は大きく阻害されたが、この系にYjeQ、Era、RbfA、RimM、RimPなどのリボソーム生合成因子を加えることにより、リボソームの生合成は大きく促進された。これらの結果は、生体内においては、生合成因子がリボソームの生合成に大きく関与しており、効率の高い生体内の反応に近づけるためにはこれらの因子が必須であることを示唆している。二点目については、天工合成したDHFR(ジヒドロ葉酸還元酵素)遺伝子をを鋳型に翻訳を行い、DHFRの酵素活性を測定した結果、転写したtRNAのみで合成したDHFRが天然のtRNAのみで合成したDHFRと同様の比活性を保持することを確認した。これは、未修飾のtRNAのみを用いたシステムによっても遺伝暗号解読は正常に行われることを示すものであり、無細胞蛋白質合成システムの自己複製という本研究め目的にとって重要な知見であると考えられる。

Research Products

• [Journal Article] Real-time monitoring of cell-free translation on a quartz-crystal microbalance (2009)
  • Author(s): Shuntaro Takahashi
  • Journal Title: Journal of the American Chemical Society 131 Pages: 9326-9332
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epitope mapping using ribosome display in a reconstituted cell-free protein synthesis system (2009)
  • Author(s): Eriko Osada
  • Journal Title: Journal of Biochemistry 145 Pages: 693-700
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] 70 S ribosomes bind to Shine-Dalgarno sequences without requ ired dissociations (2008)
  • Author(s): Shuntaro Takahashi
  • Journal Title: Chembiochem 9 Pages: 870-873
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Single-molecule imaging of full protein synthesis by immobilized ribosomes (2008)
  • Author(s): Sotaro Uemura
  • Journal Title: Nucleic Acids Research 36
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系における30Sリボソームサブユニットの再構成 (2009)
  • Author(s): 田丸大知
  • Organizer: 細胞を創る研究会2.0
  • Place of Presentation: 東京大学
  • Year and Date: 2009-10-02
• [Presentation] Reconstitution of tRNA in a cell-free protein synthesis system (2008)
  • Author(s): 清水義宏
  • Organizer: 第17回理研CDBミーティング
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2008-10-14
• [Presentation] Reconstitution of tRNA in a cell-free protein synthesis system (2008)
  • Author(s): Yoshihiro Shimizu
  • Organizer: Synthetic Biology 4.0
  • Place of Presentation: Hong Kong, China
  • Year and Date: 2008-10-10
• [Presentation] Reconstitution of ribosome (2008)
  • Author(s): Daichi Tamaru
  • Organizer: Synthetic Biology 4.0
  • Place of Presentation: Hong Kong, China
  • Year and Date: 2008-10-10
• [Presentation] 再構築型無細胞蛋白質合成システムの開発とその応用 (2008)
  • Author(s): 清水義宏
  • Organizer: 大阪大学蛋白質研究所セミナー
  • Place of Presentation: 大阪
  • Year and Date: 2008-09-25
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系におけるtRNAの再構成 (2008)
  • Author(s): 清水義宏
  • Organizer: 第10回RNAミーティング
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2008-07-23
• [Presentation] 無細胞タンパク質合成系における30Sリボソームサブユニットの再構成 (2008)
  • Author(s): 田丸大知
  • Organizer: 第10回RNAミーティング
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2008-07-23
• [Presentation] H/D交換と質量分析法による70Sリボソーム蛋白質ダイナミクスのMg^<2+>濃度依存性解析 (2008)
  • Author(s): 山本竜也
  • Organizer: 第10回RNAミーティング
  • Place of Presentation: 札幌
  • Year and Date: 2008-07-23