宿主と連携したEBウイルスDNA複製開始機構の解明と人工複製開始点構築への応用

• Project/Area Number: 20055010
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Japan Women's University
• Principal Investigator: 和賀 祥 Japan Women's University, 理学部, 准教授 (60222402)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000); Fiscal Year 2009: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000); Fiscal Year 2008: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
• Keywords: EBウイルス / EBNA1 / DNA複製 / ORC

Research Abstract

EBウイルスDNAがもつ複製開始点oriPは、そこからの複製にヒト複製開始因子ORCが必要であることから、哺乳細胞DNA複製の良いモデル系となっている。oriP複製には、ウイルス由来複製因子EBNA1が必要であるが、EBNA1の役割の詳細は未だ明らかではない。これまでの解析から、精製したORC複合体がG-rich RNAに高い親和性を有することを見出している。この結果と既に報告のあるEBNA1のもつG-rich RNA結合活性とを考え合わせ、共通RNAを介したEBNA1-RNA-ORC複合体がoriPで形成する可能性が考えられた。そこで本年度は、この可能性をin vivo解析で証明するために、まずRNA結合活性を欠損したEBNA1変異体の作製を行った。EBNA1は直接RNA結合に関わると考えられるRGGモチーフを2つ有する。本解析ではこのRGGモチーフ内の重要なアミノ酸を別種に置換した変異体の作製を行った。そして、作製した変異体をヒト培養細胞で発現させたところ、いずれの変異体も野生型と同様に、発現したEBNA1は核に局在した。このことは、作製した変異EBNA1が今後のin vivo複製アッセイによるEBNA1機能解析に利用できることを示す。
また、EBNA1の解析と平行して本年度は、細胞性転写因子かつ複製開始因子であるAlF-Cに着目した解析に着手した。この因子は、DNA配列特異的DNA結合タンパク質であるが、そのアミノ酸配列からRNA結合活性も有することが推測された。本年度はその組換え体AlF-Cを使った解析から、実際にRNA結合活性を有すること、さらにEBNA1と同様にG-richのRNAに結合選択性があることが分かった。今後、AlF-Cについても、共通のRNAを介したORCとの複合体形成が特定のDNA上で起こるのかを明らかにしていきたい。

Research Products

• [Journal Article] Near-full-length REV3L appears to be a scarce maternal factor in Xenopus laevis eggs that changes qualitatively in early embryonic development (2010)
  • Author(s): Daichi Ogawara
  • Journal Title: DNA repair 9 Pages: 90-95
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Redundant and differential regulation of multiple licensing factors ensures prevention of re-replication in normal human cells (2009)
  • Author(s): Nozomi Sugimoto
  • Journal Title: Journal of Cell Science 122 Pages: 1184-1191
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Possible direct involvement of RNA in recruiting the origin recognition complex to the viral and cellular replication origins (2009)
  • Author(s): Noriko Kiyasu
  • Organizer: 第32回日本分子生物学会年会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜(神奈川県)
  • Year and Date: 2009-12-11
• [Presentation] EBウイルス複製開始点oriPにおける複製開始複合体形成へのRNAの関与 (2009)
  • Author(s): 和賀祥
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会シンポジウム
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド(兵庫県)
  • Year and Date: 2009-10-24
• [Presentation] Possible direct involvement of RNA regulating the function and establishment of metazoan replication origins (2009)
  • Author(s): Shou Waga
  • Organizer: Switzerland-Japan joint meeting on the molecular mechanisms regulating "Chromo-some dynamics and genomic stability"
  • Place of Presentation: Villars-sur-Ollons, Switzerland
  • Year and Date: 2009-05-15
• [Presentation] RNA結合因子およびRNAの真核生物DNA複製開始への関与の可能性 (2008)
  • Author(s): 和賀祥
  • Organizer: 第31回日本分子生物学会年会、第81回日本生化学会大会合同大会
  • Place of Presentation: 神戸ポートアイランド
  • Year and Date: 2008-12-09