タグー小分子プローブペアによるタンパク質複合体形成の可視化

• Project/Area Number: 20056014
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 王子田 彰夫 Kyoto University, 工学研究科, 講師 (10343328)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥4,400,000 (Direct Cost: ¥4,400,000); Fiscal Year 2009: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2008: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000)
• Keywords: バイオイメージング / タンパク質 / タンパク質間相互作用 / 分子認識 / 有機化学 / 蛍光プローブ / ペプチドタグ / 膜受容体

Research Abstract

(1) CA6D4タグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞機能解析への応用
本年度は、これまで開発を進めてきたCA6D4タグを用いた「リアクティブタグシステム」を応用したブラジキン受容体やアセチルコリン受容体などの代表的なGタンパク質関連膜受容体(GPCR)の機能解析について検討を行った。結果として、CA6D4タグを導入して細胞発現させた膜受容体を蛍光プローブにより共有結合ラベル化後に、アゴニスト刺激に伴うインターナリゼーションの経時的な蛍光可視化や、インターナリゼーションする膜受容体を含むエンドソーム内部の酸性化の蛍光検出に成功した。また、エンドソーム内部のプロテアーゼ活性の上昇の蛍光検出への応用も行い、良好な結果を得つつある。これらの成果は、本研究において開発を進めてきた「リアクティブタグシステム」が細胞機能の解析に有用なツールとなる事を明確に示す結果である。
(2) Hisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系バイオイメージングへの応用
これまで開発を進めてきたHisタグに対する「リアクティブタグシステム」の細胞系での応用を目指して、Hisタグ配列の最適化およびプローブ構造の改良を進めた。様々な検討の結果、1) 反応性の高いシステイン残基のHisタグへの導入、2) プローブNi錯体部位のダイマー化によるHisタグとの親和性の向上、3) 反応部位をベンゼンフルフォン酸エステルからα-クロロアセチル基へ変更の三点の改善を行うことにより、HisタグモデルペプチドやHisタグ導入タンパク質を低濃度条件下において迅速にラベル化可能な反応システムへ改善する事に成功した。

Research Products

• [Journal Article] Binuclear Ni(II)-DpaTyr Complex as a High Affinity Probe for an Oligo-Aspartate Tag Tethered to Proteins (2010)
  • Author(s): A.OJIDA, S.FUJISHIMA, K.HONDA, H.NONAKA, S.UCHINOMIYA, I.HAMACHI
  • Journal Title: Chemistry-An Asian Journal 5 Pages: 877-886
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Site-Specific Covalent Labeling of His-tag Fused Proteins with a Reactive Ni(II)-NTA probe (2009)
  • Author(s): S.UCHINOMIYA, H.NONAKA, S.FUJISHIMA, S.TSUKIJI, A.OJIDA, I.HAMACHI
  • Journal Title: Chemical Commucations 39 Pages: 5880-5882
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] FLAG-tag Selective Covalent Protein Labeling via a Binding-Induced Acyl-Transfer Reaction (2009)
  • Author(s): H.NONAKA, S.FUJISHIMA, S.UCHINOMIYA, A.OJIDA, I.HAMACHI
  • Journal Title: Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 19 Pages: 6696-6699
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 生体機能を解き明かすツールとしての小分子プローブの開発 (2009)
  • Author(s): 王子田彰夫
  • Organizer: 生体機能関連化学 若手の会
  • Place of Presentation: 関西セミナーハウス(京都)
  • Year and Date: 2009-07-13
• [Presentation] 生体機能解析に使いたくなる蛍光プローブの開発 (2009)
  • Author(s): 王子田彰夫
  • Organizer: 有機合成化学講演会
  • Place of Presentation: 九州大学(福岡)
  • Year and Date: 2009-05-22
• [Presentation] D4タグに対するリアクティブタグシステムの開発 (2009)
  • Author(s): 王子田彰夫、野中洋、藤島祥平、内之宮祥平、浜地格
  • Organizer: 日本化学会第89春季年会
  • Place of Presentation: 日本大学船橋キャンパス
  • Year and Date: 2009-03-28
• [Presentation] Hisタグに対するリアクティブタグシステムの開発 (2009)
  • Author(s): 内之宮祥平、野中洋、藤島祥平、王子田彰夫、浜地格
  • Organizer: 日本化学会第89春季年会
  • Place of Presentation: 日本大学船橋キャンパス
  • Year and Date: 2009-03-28
• [Presentation] バイオイメージングめための新しいタンパク質ラベル化技術の開発 (2008)
  • Author(s): 王子田彰夫
  • Organizer: 生理学研究所公開セミナー
  • Place of Presentation: 生理学研究所(岡崎市)
  • Year and Date: 2008-11-25