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抗リン酸化ペプチド抗体を用いた細胞周期制御機構の可視化

Research Project

Project/Area Number 20058009
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Biological Sciences
Research InstitutionThe University of Tokyo

Principal Investigator

上田 宏  The University of Tokyo, 大学院・工学系研究科, 准教授 (60232758)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 伊原 正喜  東京大学, 大学院・工学系研究科, 特任助教 (50391868)
Project Period (FY) 2008 – 2009
Project Status Completed (Fiscal Year 2009)
Budget Amount *help
¥4,800,000 (Direct Cost: ¥4,800,000)
Fiscal Year 2009: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2008: ¥2,400,000 (Direct Cost: ¥2,400,000)
Keywords生物・生体工学 / 分析化学 / 蛋白質 / 可視化 / 細胞信号伝達 / 分析科学
Research Abstract

本年度は(1)FRET法による細胞骨格微小管蛋白ビメンチンのリン酸化検出プローブの最適化,ならびに(2)抗体可変領域の抗原による安定化を利用した新規イメージング法の開発を目標に研究を行った。
(1)では前年度に得られた、細胞周期によりそのリン酸化が制御されるビメンチンのセリン71リン酸化認識抗体TM71発現系を用い、オープンサンドイッチ(OS)法によるリン酸化検出を試みた。VH/VL相互作用に影響を与えるH39への変異導入によりOS-ELISAの応答性(S/B比)が顕著に向上したため,この変異体VHならびにVLをTrx融合蛋白質として酸化的細胞質を持つ大腸菌で発現させ,それぞれAlexa488とRhodamineXで蛍光ラベルし混合して試験管内で蛍光スペクトルを測定した。この結果,抗原ペプチド依存的な最大18%の蛍光強度比変化が得られた。これを電気穿孔法によりU251細胞に導入し,高感度カメラを用いて蛍光顕微鏡観察したところcleavage furrowへの局在と若干のFRET比の変化が見られた。現在各種条件で追試を行っている。
(2)では,抗原結合により蛍光強度が増強する新規蛍光ラベル化抗体"Quenchbody"の開発に成功した。具体的には,無細胞タンパク質合成系を用いて抗体VHのN末端近傍に蛍光ラベルをピンポイント導入することで,複数の低分子抗原認識FvあるいはscFvにおいて共存する抗原濃度依存的に蛍光強度が最大6倍増大する現象を発見した。メカニズムは現在解析中であるが,VH/VL界面に存在する複数のTrp残基の変異で抗原非存在時の蛍光強度が増大することから,これらの残基による蛍光のクエンチが重要であり,これが抗原結合に伴うFv安定化により解消することが考えられる。FRET法に比べて応答性に優れるこの方法を,今後各種細胞内リン酸化検出系に応用していきたい。

Report

(2 results)
  • 2009 Annual Research Report
  • 2008 Annual Research Report
  • Research Products

    (13 results)

All 2010 2009 2008 Other

All Journal Article (6 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (2 results) Book (1 results) Remarks (2 results) Patent(Industrial Property Rights) (2 results)

  • [Journal Article] Rapid noncompetitive detection of a small biomarker peptide by open-sandwich enzyme linked immunosorbent assay(OS-ELISA)integrated into microfluidic device2010

    • Author(s)
      M.Ihara, A.Yoshikawa, Y.Wu, H.Takahashi, K.Mawatari, K.Shimura, K.Sato, T.Kitamori, H.Ueda
    • Journal Title

      Lab.Chip 10

      Pages: 92-100

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  • [Journal Article] Open-sandwich enzyme immunoassay for one-step noncompetitive detection of corticosteroid 11-deoxycortisol2009

    • Author(s)
      M.Ihara, T.Suzuki, N.Kobayashi, J.Goto, H.Ueda
    • Journal Title

      Anal.Chem. 81

      Pages: 8298-8304

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Cyclic RGD Peptide-Labeled Upconversion Nanophosphors for Tumor Cell-Targeted Imaging2009

    • Author(s)
      T.Zako, H.Nagata, N.Terada, A.Utsumi, M.Sakono, M.Yohda, H.Ueda, K.Soga, M.Maeda
    • Journal Title

      Biochem.Biophys.Res.Commun. 381

      Pages: 54-58

    • Related Report
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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Antibody Fab display system that can perform open sandwich ELISA2009

    • Author(s)
      J. Dong, M. Ihara and H. Ueda
    • Journal Title

      Anal. Biochem 386

      Pages: 36-44

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A new gibberellin detection system in living cells based on VH/VL inte raction of antibody2008

    • Author(s)
      Y. Lee, T. Asami, I. Yamaguchi, H. Ueda and Y. Suzuki
    • Journal Title

      iochem. Biophys. Res. Commun 376

      Pages: 134-138

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    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 第三の免疫測定法「オープンサンドイッチ法」の開発2008

    • Author(s)
      伊原正喜, 上田宏
    • Journal Title

      化学工学 72

      Pages: 486-488

    • NAID

      10021982289

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  • [Presentation] Quenchbody : An antibody probe that fluoresces upon binding with antigen2010

    • Author(s)
      H.Ueda
    • Organizer
      Gordon Research Conference on Antibody Biology and Engineering
    • Place of Presentation
      Ventura Beach Marriott, Bentura, CA, USA
    • Year and Date
      2010-03-10
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  • [Presentation] Open sandwich immunoassay for the realtime imaging of intracellular protein phosphorylation2009

    • Author(s)
      H. Ueda
    • Organizer
      The International symposium on the MEXT priority research nroiect 'Cell oroliferation control'
    • Place of Presentation
      ルプラ王山, 名古屋
    • Year and Date
      2009-02-28
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  • [Book] コンビナトリアル・バイオエンジニアリング2010

    • Author(s)
      上田宏, 他, 植田充美監修(共著)
    • Total Pages
      12
    • Publisher
      シーエムシー出版
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  • [Remarks]

    • URL

      http://park.itc.u-tokyo.ac.jp/hueda/

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  • [Remarks]

    • URL

      http://park.itc.utokyo.ac.jp/hueda/

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  • [Patent(Industrial Property Rights)] 蛍光免疫測定方法2009

    • Inventor(s)
      上田宏, 阿部亮二, 伊原正喜, 恵比須省吾, 高木広明
    • Industrial Property Rights Holder
      (株)プロテイン・エクスプレス
    • Industrial Property Number
      2009-264420
    • Filing Date
      2009-11-19
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  • [Patent(Industrial Property Rights)] 複数の蛋白質の間の相互作用を測定する方法2009

    • Inventor(s)
      上田宏, 長棟輝行
    • Industrial Property Rights Holder
      東京大学
    • Acquisition Date
      2009-08-16
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Published: 2008-04-01   Modified: 2018-03-28  

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