大規模リン酸化プロテオーム解析による細胞周期制御機構の解明

• Project/Area Number: 20058028
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: Biological Sciences
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 松本 雅記 Kyushu University, 生体防御医学研究所, 准教授 (60380531)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 押川 清孝 九州大学, 生体防御医学研究所, 研究員 (50380051)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥6,600,000 (Direct Cost: ¥6,600,000); Fiscal Year 2009: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000); Fiscal Year 2008: ¥3,300,000 (Direct Cost: ¥3,300,000)
• Keywords: プロテオミクス / 細胞周期 / リン酸化 / 翻訳後修飾 / 定量プロテオーム解析

Research Abstract

前年度までにリン酸化ペプチドの精製技術を確立した。21年度は細胞内リン酸化細胞周期の全過程の解析には少なくとも4点以上の定量が必要となるため、多検体間比較定量法を構築した。当初、一般的に質量分析計による定量法として安定同位体標識アミノ酸代謝標識法(SILAC)が主流であり、これを応用した多点定量法の構築を試みたが、使用できる培養細胞が限られるなどの欠点があるため、新規リン酸化定量プロテオミクス法であるphospho-iTRAQ法の構築を試みた。
iTRAQ法は4種類,あるいは8種類の試料間の同時比較定量が可能であるため、細胞周期など時系列解析に適している。しかしながら、リン酸化の解析に適用する場合、試料の消化・リン酸ペプチドの精製後に標識を行うため、消化や精製過程での誤差が生じやすい。そこで、カゼインなどのリン酸化タンパク質を内部標準として各々の試料に少量添加することで、消化や精製の誤差を補正することを考案した。実際、実験過程で生じる誤差を内部標準由来のリン酸化ペプチドの定量値を用いて補正することが可能であった。本方法を用いて増殖因子刺激や細胞周期進行過程でリン酸化の変動を大規模に解析したところ、約10,000種類以上のリン酸化部位を同定・定量が可能であった。
得られた新規細リン酸化の細胞周期制御上の意味を検証するため当該タンパク質の機能撹乱やリン酸化部位変異体の導入による細胞周期への影響の検討、さらに、細胞内局在や他のタンパク質との相互作用の細胞周期依存性等を横断的に解析している。

Research Products

• [Journal Article] Large-scale proteomic analysis of tyrosine phosphorylation induced by TCR or BCR activation reveals new signaling pathways. (2009)
  • Author(s): Matsumoto, M., Oyamada, K., Takahashi, H., Sato, T., Hatakeyama, S., Nakayama, K.I.
  • Journal Title: Proteomics 9 Pages: 3549-3563
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Fbxo45 forms a novel ubiquitin ligase complex and is required for neuronal development. (2009)
  • Author(s): Saiga, T., Fukuda, T., Matsumoto, M., Tada, H., Okano, H.J., Okano, H., Nakayama KI.
  • Journal Title: Mol.Cell.Biol. 29 Pages: 3529-3543
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nucleolar structure and function are regulated by the deubiquitylating enzyme USP36. (2009)
  • Author(s): Endo, A., Matsumoto, M., Inada, T., Yamamoto, A., Nakayama, K.I., Kitamura, N., Komada, M.
  • Journal Title: J.Cell Sci. 122 Pages: 678-686
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Nucleolar structure and function are regulated by the deubiquitylating enzyme USP36 (2009)
  • Author(s): Endo A, Matsumoto M, Inada T, Yamamoto A, Nakayama KI, Kitamura N, Komada M.
  • Journal Title: J Cell Sci 122 Pages: 678-686
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Large-scale proteomic analysis of tyrosine phosphorylation induced by T CR or BCR activation reveals new signaling pathways (2009)
  • Author(s): Matsumoto, M, Oyamada, K., Ta kahashi, H., Sato, T., Hatakeyama, S., Nakayama KI.
  • Journal Title: Proteomics (In press)
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 定量リン酸化プロテオミクスによるシグナル伝達の包括的解析 (2009)
  • Author(s): 松本雅記、小山田浩二、中山敬一
  • Organizer: 第82回日本生化学会大会
  • Place of Presentation: 神戸
  • Year and Date: 2009-10-23
• [Presentation] 定量リン酸化プロテオミクスによるシグナル伝達の包括的解析 (2009)
  • Author(s): 松本雅記
  • Organizer: 蛋白質化学会年会
  • Place of Presentation: 熊本
  • Year and Date: 2009-05-21
• [Presentation] A GLOBAL MAP OF MITOTIC PHOSPHOPROTEOME UNCOVERS U NEXPECTED SIGNALING PATHWAYS IN MITOSIS (2008)
  • Author(s): Masaki Matsumoto, Koji Oyamada, Keiichi I. Nakayama
  • Organizer: Cold spring harbor meeting, The Cell Cycle
  • Place of Presentation: New York, USA
  • Year and Date: 2008-05-15
• [Remarks]
  • URL: http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/saibou/index.html
• [Remarks]
  • URL: http://www.bioreg.kyushu-u.ac.jp/saibou/index.html