RNA機能の光制御法に関する研究

• Project/Area Number: 20655014
• Research Category: Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
• Allocation Type: Single-year Grants
• Research Field: Analytical chemistry
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 小澤 岳昌 The University of Tokyo, 大学院・理学系研究科, 教授 (40302806)
• Project Period (FY): 2008 – 2009
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2009)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2009: ¥1,600,000 (Direct Cost: ¥1,600,000); Fiscal Year 2008: ¥1,800,000 (Direct Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: RNA / 可視化 / タンパク質

Research Abstract

本研究におけるRNA光制御の原理では、KillerRedから光照射によって発生する活性酸素がそれら阻害タンパク質を不活性化することで翻訳を開始させる。阻害タンパク質の結合領域付近にKillerRedを近接させるために、KillerRedタンパク質両端にそれぞれPum1HDを融合させたプローブを作製した。実際に培養細胞ヘプローブベクターを導入し,その発現をImmunoblottingおよび蛍光観察にて確認した。次に、光照射によってKillerRedからROSが発生するかどうかを顕微鏡下で確認した。まず、ROSを専用の蛍光検出試薬で検出した結果、ROSの増加を示す指示蛍光色を示した。また、プローブ導入済の細胞に特定波長の光を照射した結果、大きくKillerRed赤色蛍光が減衰した。この蛍光は数時間放置すると回復することから、ROSが正常に発生しプローブタンパク質自身を不活性化したと推察される。
一連のプローブ機能を検査するためのレポーター遺伝子として、発光タンパク質ホタルルシフェラーゼ遺伝子配列を用いた。この遺伝子配列上流に、KillerRedプローブの結合領域となる特定のRNA配列を設計し連結した。RNA配列にRNA検出プローブが特異的に結合することを、免疫沈降法を用いて確認した。
mRNAからの翻訳を通常状態において抑制するために、特定の阻害タンパク質が結合して翻訳を抑制するよう、プローブ結合配列のさらに上流に阻害タンパク質結合配列を連結させた。遺伝子発現が抑制されることをルシフェラーゼの発光値を時間経過的に測定することにより確認した。今後光照射による翻訳誘導の最適化を検証する。

Research Products

• [Journal Article] High-Sensitivity Real-Time Imaging of Dual Protein-Protein Interactions in Living Subjects Using Multicolor Luciferases (2009)
  • Author(s): N.Hida, et al
  • Journal Title: PLoS ONE 4
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Detection of Apoptosis Using Cyclic Luciferase in Living Mammals (2009)
  • Author(s): A.Kanno, et al.
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology 574 Pages: 289-295
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Protein Reconstitution Methods for Visualizing Biomolecular Function in Living Cell (2009)
  • Author(s): T. Ozawa
  • Journal Title: YAKUGAKU ZASSHI 129 Pages: 289-295
  • NAID: 110007123175
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Molecular Science for Analyzing Dynamics of Biomolecules in Living Cells (2008)
  • Author(s): T. Ozawa
  • Journal Title: J. JSCAS 10 Pages: 489-493
  • NAID: 10025166192
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Fluorescent and Bioluminescent Probes for Visualizing Biological Functions in Living Cells (2009)
  • Author(s): T.Ozawa
  • Organizer: NF-kB Training Session & Symposium
  • Place of Presentation: 英国(Liverpool)
  • Year and Date: 2009-07-07
• [Presentation] Fluorescent and Bioluminescent Proteins Engineered by Protein Splicing to Visualize Biological Function (2009)
  • Author(s): T.Ozawa
  • Organizer: VIII European Symposium of the Protein Society
  • Place of Presentation: スイス(Zulich)
  • Year and Date: 2009-06-16
• [Presentation] Optical Imaging Using Split-Reporter Reconstitution Analysis ; From Single Cells to Living Animals (2009)
  • Author(s): T.Ozawa
  • Organizer: 1^<st> World Congress of International Academy of Nanomedicine
  • Place of Presentation: 中国(三亞)
  • Year and Date: 2009-06-12
• [Presentation] Visualization of Biomolecules Using Split Reporter Reconstitution; From a Single Cell to Living Animals. (2008)
  • Author(s): T. Ozawa
  • Organizer: 1st Workshop in the Advanced Light Microscopy (DKFZ)
  • Place of Presentation: Heidelberg(ドイツ)
  • Year and Date: 2008-10-01
• [Book] 「生理機能を可視化する新たな分子プローブ」ナノメディシン (2008)
  • Author(s): 小澤岳昌
  • Total Pages: 11
  • Publisher: オーム社
• [Book] 可視化プローブによる時空間情報を損なわないミトコンドリアRNAの動態観察 (2008)
  • Author(s): 小澤岳昌
  • Total Pages: 7
  • Publisher: エヌ・ティー・エス
• [Book] クラゲから生まれたGFP革命 (2008)
  • Author(s): 小澤岳昌, 宮脇敦史
  • Total Pages: 4
  • Publisher: 東京化学同人