| Project/Area Number |
20659091
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Field |
Laboratory medicine
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
藏滿 保宏 Yamaguchi University, 大学院・医学系研究科, 准教授 (50281811)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
赤田 純子 山口大学, 大学院・医学系研究科, 助教 (30346548)
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| Project Period (FY) |
2008 – 2009
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2009)
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| Budget Amount *help |
¥3,200,000 (Direct Cost: ¥3,200,000)
Fiscal Year 2009: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2008: ¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000)
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| Keywords | 機能プロテオミクス / プロテインチップ / 蛋白質間相互作用 |
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| Research Abstract |
タンパク質間相互作用解析用チップ作製のために、モデル蛋白質としてHSP70.1を用いてプロトタイプの作製を目標とした。HSP70.1蛋白質にGFP、ヒスチジン-tag(His-tag)、システイン-tag(Cys-tag)を融合させたHis-GFP-HSP70.1-Cys融合蛋白質を作製し、His-tagと結合するHis-Select Nickel Affinity Gel(Niビーズ)により精製したものをCys-tagと結合するマレイミド基板に固定化させたチップを作製した。また、HSP70.1の発現量を視覚的にモニターするために緑色蛍光蛋白質GFPもHSP70.1とともに融合タンパク質として融合させた。
作製したHSP70.1-GFP搭載チップを蛍光顕微鏡(KEYENCE)とDNAアレイチップリーダー(PerkinElmer)を用いてスキャンし固定化の状態を確認したところ、概ね良好であったが、所々非特異的なシグナルを感知したため、washing過程の検討を繰り返した。その結果、2MEでブロッキングすることでかなりの非特異的なシグナルを排除することが可能となった。続いて搭載したHSP70.1が蛋白質として抗体に認識されるか否かを抗HSP70抗体を用いて確認したところ、抗体が結合して安定したシグナルを確認することができたため、次に肝細胞癌細胞株Huh7からNP40を含むlysis bufferを用いて抽出した細胞内可溶性蛋白抽出液を反応させた後にwashingを行なってから、HSP70.1に結合する蛋白質を含む溶液を抽出した。抽出液を質量分析計で解析したが、HSP70.1に結合する蛋白質の同定まではできなかった。
本研究で開発した蛋白質間相互作用解析用チップは搭載された蛋白質がしっかりと抗体に認識され、非特異的シグナルも検出されないことから、蛋白-蛋白相互作用を初めとする機能プロテオミクス研究に有効であることが期待できる。
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