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Positive and negative regulation of DNA replication by G-quadruplex/ RNA-DNA hybrids

Research Project

Project/Area Number 20H00463
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (A)

Allocation TypeSingle-year Grants
Section一般
Review Section Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
Research InstitutionTokyo Metropolitan Institute of Medical Science

Principal Investigator

正井 久雄  公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥44,850,000 (Direct Cost: ¥34,500,000、Indirect Cost: ¥10,350,000)
Fiscal Year 2023: ¥11,440,000 (Direct Cost: ¥8,800,000、Indirect Cost: ¥2,640,000)
Fiscal Year 2022: ¥11,570,000 (Direct Cost: ¥8,900,000、Indirect Cost: ¥2,670,000)
Fiscal Year 2021: ¥11,830,000 (Direct Cost: ¥9,100,000、Indirect Cost: ¥2,730,000)
Fiscal Year 2020: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
Keywordsグアニン4重鎖 / クロマチンドメイン / DNA複製タイミング / RNA-DNAハイブリッド / DNA複製開始 / クロマチンループ / 染色体高次構造 / 核膜 / 多量体形成 / グアニン4重鎖DNA
Outline of Research at the Start

G4によるDNA複製の正と負の制御機構を解明するため次のような実験を行う。
① Rif1とG4/核膜の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム:Rif1-G4複合体構造のクライオ電顕、X線構造解析等による決定。
② RNA-DNA hybrid/G4に依存する複製開始機構:in vitro複製開始反応系を用いた、複製開始部位の決定と開始機構の解析。ヒト細胞でのG4依存的複製開始系の構築。
③ RNA-DNA hybrid及びG4の細胞内動態の解析:既存のプローブ、G4リガンド、G4結合タンパク質、及び新たに開発する新規技法により、細胞内G4を網羅的に検出、細胞内動態を解析する。

Outline of Annual Research Achievements

研究代表者は、これまでのDNA複製の研究から、代表的な非B型核酸構造のRNA-DNAハイブリッド/グアニン4重鎖(G4)が、1)染色体高次構造形成を介した複製開始の阻害、及び、2) 複製開始の正のシグナル、のDNA複製の2種類の重要な側面に関与する可能性を発見した。1)では、進化的にヒトから酵母まで保存されたRif1タンパク質が、2)ではPriAおよび機能未知の新規タンパク質が、G4を直接認識することが重要である。これまでの研究から、Rif1のG4認識に必要なドメインとその相互作用の詳細を解明し、Rif1によるクロマチン高次構造形成のモデルを提出した。またRNA-DNAハイブリッド/G4からの複製開始をin vitroで再現し、G4構造の複製開始における重要性を検証した。本研究ではこれらの発見をさらに発展させ、1) Rif1のG4結合と、多量体形成能を担うドメインの詳細な解析と、それによる核膜近傍における核内染色体高次構造形成のメカニズム、2) RNA-DNAハイブリッド/G4に依存した普遍的な複製のメカニズム、さらに、3) 細胞内のRNA-DNAハイブリッド/G4を検出する新規手法の開発、4) RNA-DNAハイブリッド/G4の細胞内プロファイルの決定、5) G4構造のTAD(topologically associated domain)形成やオープンクロマチン形成における役割など、その多様な機能の一部を解明した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

1)Rif1とG4/核膜の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム:1 Rif1は、リン脂質に直接結合するとともに、リン脂質修飾(パルミトイル化)により、核膜と相互作用する可能性が示された。2 C末300アミノ酸の領域のみでリン脂質に結合するとともにパルミトイル化を受ける。3 N末Heat Repeat領域にシステインの連続配列が存在し、この変異により、C末依存的なリン脂質結合が減少する。
2)RNA-DNAハイブリッド/G4に依存する複製開始のメカニズム: G-rich配列を人為的に転写することにより、染色体複製を誘導できる可能性を示した。3)RNA-DNAハイブリッド及びG4の細胞内動態の解析と新規機能の発見:2 RNaseH1 D145Nポリペプチドプローブにより、大腸菌、分裂酵母細胞内のゲノムワイドRNA-DNA ハイブリッド部位を明らかにし、酵母では、これらの一部(~20%)がRad52により認識されるDNA損傷部位と一致することを示した。2 同様にG4プローブG4Pにより大腸菌染色体上のG4部位をゲノムワイドで検出した。3 分裂酵母ゲノム上のRNA-DNA ハイブリッド形成部位をChIP-seqにより決定した。4 大腸菌ゲノム上のRNA-DNA ハイブリッド形成部位をChIP-seqにより決定した。

Strategy for Future Research Activity

1)Rif1とG4/核膜の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム:1 Rif1C末内のリン脂質修飾(パルミトイル化)候補部位(システイン残基)に変異を有する細胞株を樹立する。2 この変異がパルミトイル化、リン脂質結合に及ぼす影響を解析する。3 すでに樹立したRif1のパルミトイル化責任酵素(S-アシルトランスフェラーゼZDHHC)の欠損株においてRif1のパルミトイル化を検証する。4 23種類のパルミトイル化酵素とRif1の相互作用を検討し、責任ZDHHCの同定を試みる。5 これらの株(ZDHHC欠損株、あるいは増産株)において、Rif1の核膜局在、複製タイミングを検討する。
2)RNA-DNAハイブリッド/G4に依存する複製開始のメカニズム:1 大腸菌ゲノム上の人為的な複製開始ユニットの複製メカニズムを解析する。2 RNA-DNAハイブリッドに依存する複製が変異率に及ぼす影響を大腸菌において慎重に検討する。3 真核細胞におけるRNA-DNAハイブリッドに依存する複製が、どのような条件下、細胞周期時に作動するかを詳細に解析する。
3)RNA-DNAハイブリッド及びG4の細胞内動態の解析と新規機能の発見:1 G4 helicase (RecQ, FancJ, DHX36など)、Topoisomerase、Senatxin(rho)変異体、などにおけるRNA-DNAハイブリッドおよびG4のゲノムプロファイルおよび細胞内動態を解析する(大腸菌、酵母、動物細胞)。2 G4リガンド-SNAP tagとSNAP-A3A シチジンデアミナーゼを用い、細胞内のG4近傍の塩基を書き換える新規技法を開発する(東京農工大・長澤教授との共同研究)

Report

(4 results)
  • 2022 Annual Research Report
  • 2021 Annual Research Report
  • 2020 Comments on the Screening Results   Annual Research Report
  • Research Products

    (57 results)

All 2023 2022 2021 2020 Other

All Int'l Joint Research (3 results) Journal Article (18 results) (of which Int'l Joint Research: 6 results,  Peer Reviewed: 18 results,  Open Access: 18 results) Presentation (33 results) (of which Int'l Joint Research: 6 results,  Invited: 7 results) Book (2 results) Remarks (1 results)

  • [Int'l Joint Research] Van Andel Research Institute(米国)

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    • Author(s)
      Hsiao Hao-Wen、Yang Chi-Chun、Masai Hisao
    • Journal Title

      Biomolecules

      Volume: 13 Issue: 1 Pages: 125-125

    • DOI

      10.3390/biom13010125

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    • Author(s)
      Yang Chi-Chun、Masai Hisao
    • Journal Title

      Molecular and Cellular Biology

      Volume: 43 Issue: 1 Pages: 1-21

    • DOI

      10.1080/10985549.2022.2160598

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      Kanoh Yutaka、Ueno Masaru、Hayano Motoshi、Kudo Satomi、Masai Hisao
    • Journal Title

      Life Science Alliance

      Volume: 6 Issue: 4 Pages: e202201603-e202201603

    • DOI

      10.26508/lsa.202201603

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      Nakamura Hideaki、Sekine Hiroki、Kato Hiroyuki、Masai Hisao、Gradin Katarina、Poellinger Lorenz
    • Journal Title

      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 298 Issue: 7 Pages: 102137-102137

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2022.102137

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      Masai Hisao
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      The Journal of Biochemistry

      Volume: 172 Issue: 2 Pages: 57-60

    • DOI

      10.1093/jb/mvac042

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    • Author(s)
      Masai Hisao
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      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 633 Pages: 77-80

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2022.09.060

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      Scientific Reports

      Volume: 11 Issue: 1 Pages: 4538-4538

    • DOI

      10.1038/s41598-021-83857-y

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    • Author(s)
      Nakamura K, Sakai S, Tsuyama J, Nakamura A, Otani K, Kurabayashi K, Yogiashi Y, Masai H, Shichita T
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      PLOS Biol

      Volume: 19 Issue: 5 Pages: e3000939-e3000939

    • DOI

      10.1371/journal.pbio.3000939

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      Yoshizawa-Sugata Naoko、Yamazaki Satoshi、Mita-Yoshida Kaoru、Ono Tomio、Nishito Yasumasa、Masai Hisao
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      Journal of Biological Chemistry

      Volume: 297 Issue: 6 Pages: 101367-101367

    • DOI

      10.1016/j.jbc.2021.101367

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  • [Journal Article] Discovery of AS-0141, a Potent and Selective Inhibitor of CDC7 Kinase for the Treatment of Solid Cancers2021

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      Irie Takayuki、Asami Tokiko、Sawa Ayako、Uno Yuko、Taniyama Chika、Funakoshi Yoko、Masai Hisao、Sawa Masaaki
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      Journal of Medicinal Chemistry

      Volume: 64 Issue: 19 Pages: 14153-14164

    • DOI

      10.1021/acs.jmedchem.1c01319

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      Oki Masaya、Masai Hisao
    • Journal Title

      The Journal of Biochemistry

      Volume: - Issue: 6 Pages: 629-632

    • DOI

      10.1093/jb/mvab040

    • NAID

      40022686976

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    • Author(s)
      Hsiao Hao-Wen、Yang Chi-Chun、Masai Hisao
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      Genome Instability & Disease

      Volume: 2 Issue: 5 Pages: 263-280

    • DOI

      10.1007/s42764-021-00049-8

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    • Author(s)
      Masai Hisao、Kanoh Yutaka、Kakusho Naoko、Fukatsu Rino
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 531 Issue: 1 Pages: 75-83

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.05.191

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    • Author(s)
      Fracassi Alessandro、Cao Jianbo、Yoshizawa-Sugata Naoko、T?th ?va、Archer Corey、Gr?ninger Olivier、Ricciotti Emanuela、Tang Soon Yew、Handschin Stephan、Bourgeois Jean-Pascal、Ray Ankita、Liosi Korinne、Oriana Sean、Stark Wendelin、Masai Hisao、Zhou Rong、Yamakoshi Yoko
    • Journal Title

      Chemical Science

      Volume: 11 Issue: 44 Pages: 11998-12008

    • DOI

      10.1039/d0sc04106h

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    • Author(s)
      Masai Hisao、Tanaka Taku
    • Journal Title

      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 531 Issue: 1 Pages: 25-38

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.05.132

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    • Author(s)
      Alavi Sana、Ghadiri Hamed、Dabirmanesh Bahareh、Moriyama Kenji、Khajeh Khosro、Masai Hisao
    • Journal Title

      The Journal of Biochemistry

      Volume: 169 Issue: 1 Pages: 1-14

    • DOI

      10.1093/jb/mvaa128

    • NAID

      40022490610

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    • Author(s)
      Masai Hisao、Tan Zheng
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      Biochemical and Biophysical Research Communications

      Volume: 531 Issue: 1 Pages: 1-2

    • DOI

      10.1016/j.bbrc.2020.05.092

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    • Author(s)
      Kato H, Asamitsu K, Sun W, Kitajima S, Yoshizawa-Sugata N, Okamoto T, Masai H, Poellinger L
    • Journal Title

      Oncogene.

      Volume: 39 Issue: 16 Pages: 3322-3335

    • DOI

      10.1038/s41388-020-1218-3

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    • Author(s)
      Hisao Masai , Chi-Chun Yang, Hao-Wen Hsiao , Zhiying You
    • Organizer
      ATW2023
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    • Author(s)
      Hisao Masai, Taku Tanaka, Rino Fukatsu, Tomoko Sagi
    • Organizer
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  • [Presentation] 核酸-タンパク質-リン脂質相互作用を介した染色体高次構造の形成2022

    • Author(s)
      正井 久雄、井口 智弘、伊藤 さゆり、覚正 直子、深津 理乃、森山 賢治、笹沼 博之
    • Organizer
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    • Author(s)
      正井 久雄 、 田中 卓 、鷺 朋子 、深津 理乃 、関 由美香
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020 ワークショップ 『核様体DNAの複製と品質維持の最前線研究』
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      2020 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Cdc7ーASKキナーゼ複合体の脳の発生における役割2020

    • Author(s)
      堀 かりん、 井口 智弘、山崎 聡志、小野 富男、丸山 千秋、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 転写によるRNA-DNAハイブリッド上でのG4構造形成2020

    • Author(s)
      井上 直也 、覺正 直子 、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 細胞融合によるPD-L1の発現上昇は腫瘍形成を促進する2020

    • Author(s)
      田島 陽一 、 芝崎 太 、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 免疫細胞の増殖と分化におけるCdc7と活性化サブユニットASK(Dbf4)の役割2020

    • Author(s)
      井口 智弘、 山崎 聡志、小野 富男、石井 里絵、堀 かりん、小林 駿介、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] multi-replicon 様式の大腸菌染色体複製メカニズム2020

    • Author(s)
      田中 卓、 鷺 朋子、西藤 泰昌、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] Rif1多量体形成能の複製タイミング制御における役割の解明2020

    • Author(s)
      高沢 佳芳、 加納 豊、松本 清治、小林 駿介、深津 理乃、覺正 直子、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] RNA-DNAハイブリッド/G4構造に依存する大腸菌plasmidの複製開始メカニズムの解析2020

    • Author(s)
      深津 理乃 、 田中 卓 、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] リン酸化によるClaspinの分子内相互作用によるDNA複製の制御2020

    • Author(s)
      YOU Zhiying 、 YANG ChiChun 、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 分裂酵母のRif1の過剰発現は増殖を阻害し、M期の進行を妨害することで細胞死を誘導する2020

    • Author(s)
      加納 豊、 松本 清治、上野 勝、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] 大腸菌におけるゲノム上のRNA-DNA hybrid・グアニン4重鎖構造のプロファイルと第二の複製系での役割の解明2020

    • Author(s)
      鷺 朋子、 田中 卓、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] ClaspinはPI3 kinaseとmTORと相互作用し、血清飢餓からの増殖と栄養系シグナル伝達に必要である2020

    • Author(s)
      楊 其駿 、 正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] ヒトRif1C末領域はその核膜局在と複製タイミング制御に必要とされる2020

    • Author(s)
      伊藤 さゆり、 井口 智弘、覺正 直子、大字 亜沙美、平谷 伊智朗、正井 久雄
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Presentation] Molecular Insights into Claspin-Mediated Skew of CD4+ T Cell Differentiation and Its Response to Replication Stress.2020

    • Author(s)
      HSIAO Hao-Wen、 IGUCHI Tomohiro、MASAI Hisao
    • Organizer
      第43回日本分子生物学会年会 MBSJ2020
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      2020 Annual Research Report
  • [Book] 実験医学増刊 Vol.40 No.12 セントラルドグマの新常識2022

    • Author(s)
      正井 久雄
    • Total Pages
      264
    • Publisher
      羊土社
    • ISBN
      9784758104043
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  • [Book] 科学フォーラム 432号2022

    • Author(s)
      井口 智弘、正井 久雄
    • Total Pages
      53
    • Publisher
      学校法人東京理科大学
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  • [Remarks] ゲノム動態プロジェクト

    • URL

      https://www.igakuken.or.jp/genome/

    • Related Report
      2022 Annual Research Report 2021 Annual Research Report 2020 Annual Research Report

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Published: 2020-04-28   Modified: 2024-12-25  

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