Elucidation of the gene expression cascade responsible for male sexuality and acquisition of fertility

• Project/Area Number: 20H00469
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: Jichi Medical University
• Principal Investigator: 本多 新 自治医科大学, 医学部, 教授 (10373367)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 磯谷 綾子 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (20444523) ; 的場 章悟 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 専任研究員 (20585202) ; 大田 浩 京都大学, 医学研究科, 准教授 (50391892)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥42,900,000 (Direct Cost: ¥33,000,000、Indirect Cost: ¥9,900,000); Fiscal Year 2024: ¥8,710,000 (Direct Cost: ¥6,700,000、Indirect Cost: ¥2,010,000); Fiscal Year 2023: ¥8,450,000 (Direct Cost: ¥6,500,000、Indirect Cost: ¥1,950,000); Fiscal Year 2022: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000); Fiscal Year 2021: ¥7,930,000 (Direct Cost: ¥6,100,000、Indirect Cost: ¥1,830,000); Fiscal Year 2020: ¥8,450,000 (Direct Cost: ¥6,500,000、Indirect Cost: ¥1,950,000)
• Keywords: 性決定 / 絶滅危惧種 / iPS細胞 / 生殖巣 / 生殖細胞 / アマミトゲネズミ / 胚盤胞補完法 / マウス / ラット / 生殖細胞体外再構築

Outline of Research at the Start

アマミトゲネズミiPS細胞を用いて、体内（異種間キメラ作成）および体外（分化誘導）でアマミトゲネズミの生殖巣および生殖細胞を作成する。作成される生殖巣や生殖細胞がいかにして分化するのかを分子レベルで解明する。絶滅危惧種アマミトゲネズミから樹立された真のナイーブ型iPS細胞を活用して、ほとんどゲノム雌雄差のない状況から雄が発生し、その雄が妊孕性を獲得する過程、その遺伝子発現カスケードを解明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究はY染色体に依存しない性染色体様式XO型で雌雄を生じる、絶滅危惧種のアマミトゲネズミからiPS細胞を樹立し、どのように雌雄が生じるのかを解明することを目的としている。今年度はオス特異的なゲノム領域の解析と、そのシステムを雌iPS細胞へ導入、および生殖巣補完の予備実験を行った。また、トゲネズミ由来iPS細胞をより効率よくキメラとして生殖系列に寄与させるために、新規iPS細胞株を樹立する研究にも着手し始めた。これまでに樹立したアマミトゲネズミのオス由来iPS細胞はキメラとしてマウスに寄与する能力に乏しく、また生殖系列にも寄与しないことから、これまでとは異なる体細胞株を用い、かつリプログラム因子についてもより質の高い多能性幹細胞として樹立可能となる因子を導入して樹立している。一方、トゲネズミの全ゲノム解析より明らかになった雄性決定様式を雌に導入することで、実際にその仕組みがXO型動物の雄性決定に関与するのか否かを解析している。CRISPR/Cas9を用いた生殖巣補完については、胚をマウスおよびラットで行ったが、F0世代でホモの胚が生じる効率だけでなく、トゲネズミiPS細胞が寄与する効率の問題もあるため、期待していたほどの補完胚が得られなかった。そこで、ヘテロ欠損でも補完できるDTAシステムを導入し、現在予備実験を行っている。このシステムが機能すれば補完用のホスト胚効率を自在に操作できる。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

これまでに樹立したアマミトゲネズミのオス由来iPS細胞はキメラとしてマウスに寄与する能力に乏しく、また生殖系列にも寄与しないことから、これまでとは異なる体細胞株を用い、かつリプログラム因子についてもより質の高い多能性幹細胞として樹立可能となる因子を導入して樹立している。また、CRISPR/Cas9を用いた生殖巣補完については、胚をマウスおよびラットで行ったが、F0世代でホモの胚が生じる効率だけでなく、トゲネズミiPS細胞が寄与する効率の問題もあるため、期待していたほどの補完胚が得られなかった。

Strategy for Future Research Activity

オスのアマミトゲネズミiPS細胞がキメラ形成能に乏しいことが判明したため、トゲネズミ由来iPS細胞をより効率よくキメラとして生殖系列に寄与させるために、新規iPS細胞株を樹立する研究にも着手し始めた。これまでとは異なる体細胞株を用い、かつリプログラム因子についてもより質の高い多能性幹細胞として樹立可能となる因子を導入して樹立している。胚盤胞補完法による生殖巣補完については、ヘテロ欠損でも補完できるDTAシステムを導入し、現在予備実験を行っている。このシステムが機能すれば補完用のホスト胚効率を自在に操作できる。

Research Products

• [Journal Article] A Simple and Efficient Method for Generating KO Rats Using In Vitro Fertilized Oocytes (2023)
  • Author(s): Kohtaro Morita, Arata Honda, Masahide Asano
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2637 Pages: 233-246
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-3016-7_18
  • ISBN: 9781071630150, 9781071630167
• [Journal Article] Gene Targeting in Rabbits: Single-Step Generation of Knockout Rabbits by Microinjection of CRISPR/Cas9 Plasmids (2023)
  • Author(s): Arata Honda
  • Journal Title: Methods in Molecular Biology Volume: 2637 Pages: 255-267
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-3016-7_20
  • ISBN: 9781071630150, 9781071630167
• [Journal Article] Scheduled simple production method of pseudopregnant female mice for embryo transfer using the luteinizing hormone-releasing hormone agonist (2022)
  • Author(s): Gema Puspa Sari, Patrick Louis Lagman Hilario, Shunsuke Yuri 1, Arata Honda, Ayako Isotani
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 21985-21985
  • DOI: 10.1038/s41598-022-26425-2
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 絶滅危惧種を知るために精子と卵子をつくりだす (2022)
  • Author(s): 本多新
  • Organizer: 第115回日本繁殖生物学会
  • Invited
• [Patent(Industrial Property Rights)] 不等分裂抑制剤、染色体異数性抑制剤、培地、体外受精培地、細胞処理キット、不等分裂抑制方法、体外受精方法、移植方法、不妊治療方法、及び産仔取得方法 (2022)
  • Inventor(s): 本多新
  • Industrial Property Rights Holder: 自治医科大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2022
  • Overseas