組織学と複合した単一細胞DNAメチル化解析法による原始卵胞淘汰過程の解明

• Project/Area Number: 20H00471
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Medium-sized Section 44:Biology at cellular to organismal levels, and related fields
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 栗本 一基 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20415152)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2024)
• Budget Amount: ¥44,460,000 (Direct Cost: ¥34,200,000、Indirect Cost: ¥10,260,000); Fiscal Year 2024: ¥12,740,000 (Direct Cost: ¥9,800,000、Indirect Cost: ¥2,940,000); Fiscal Year 2023: ¥12,220,000 (Direct Cost: ¥9,400,000、Indirect Cost: ¥2,820,000); Fiscal Year 2022: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2021: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2020: ¥8,840,000 (Direct Cost: ¥6,800,000、Indirect Cost: ¥2,040,000)
• Keywords: レーザーマイクロダイセクション / DNAメチローム / 生殖細胞 / 1細胞解析 / 空間オミクス / 配偶子形成 / シングルセル / DNAメチル化 / トランスクリプトーム / メチローム / 組織切片 / エピゲノム / 1細胞 / RNA-seq / 単一細胞 / 形態 / LCM / PBAT / メチル化 / 原始卵胞 / 単一細胞解析

Outline of Research at the Start

生殖細胞系列は世代を越えた生命継承の要であり、その品質管理機構は発生学や生殖医学における重要な未解明問題である。胚生期に、特異なDNAメチル化プロファイルを獲得した卵母細胞は、支持細胞と密接に相互作用して原始卵胞を形成し、生涯に渡り激しい淘汰にさらされる。この過程では、卵子のもととなる卵母細胞が、支持細胞である顆粒膜細胞と密接に相互作用し、DNAメチル化を含むゲノムへの化学修飾に影響を与えながら、次の世代を発生させる準備を行うと考えられる。本研究では、卵巣の組織学的情報を得つつ、その組織切片から細胞を採取して遺伝子発現やDNAメチル化を単一細胞レベル解析する手法を開発し原始卵胞の淘汰過程を解析する。

Outline of Annual Research Achievements

本年度は凍結切片からの遺伝子発現解析法DRaqLを論文発表した。DRaqLとDNAメチル化の複合の拡張性を向上させるために、凍結組織切片のアルコール固定やホルマリン固定だけでなくパラフィン包埋した組織にも対応可能にした。また、溶解条件や切片の最適な作成条件が、組織によって異なることが分かったため、卵巣以外にマウス骨格筋に対してDRaqLによるcDNA増幅法（DRaqL-Smart-seq2）と、ホルマリン固定のための手法（DRaqL-Protease-Smart-seq2）に対する条件の幅を決定した。凍結切片では短時間の溶解で効率の良いcDNA増幅が可能であったが、FFPEではより長時間のプロテアーゼ処理や、キシレンによって徹底的に脱パラフィン処理をすることが必要であった。プロテアーゼ処理の時間の延長幅と、効率的な細胞の可溶化とRNAの保護を両立する反応温度の幅を決定した。またマウス卵巣を用いて新鮮な状態の卵母細胞と顆粒膜細胞を単離し1細胞ずつ単離回収して、一般的な単一細胞cDNA増幅（Smart-seq2）を行い、DRaqLを用いた切片からの1細胞RNA-seq（DRaqL-Smart-seq2）と比較して、切片からの1細胞解析の感度が、新鮮なまま単離した生の細胞に対する解析とほとんどそん色がないことを確かめた。これら、DRaqLのバリエーションに対応したDNAメチル化解析を、卵巣切片から行えるようにPBATによるライブラリ調製条件を検討した。PBATのライブラリ調製は、費用対効果と実験条件の検討の結果、開発者である三浦史仁博士（九州大学）が主宰する解析支援AMED BINDS「メチロームおよび多重エピゲノム解析の支援」と共同で進めることにした。マウス卵胞から、卵母細胞と顆粒膜細胞を切り出し九州大学に送付しライブラリ調製してどの程度の解析深度が出るかを解析する計画である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、DNAメチル化解析への複合適用性を向上させるための切片からの溶解条件、cDNA増幅法および、対象組織への適用性を拡大した。DNAメチル化解析のためのライブラリ調製法を決定し、実際の生殖細胞を用いた検討を開始した。これらの理由から本研究はおおむね順調に進行していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

前年度に緩和したDNAメチル化解析の実験条件に基づいて、卵巣切片から採取した細胞についてPBATで作製したライブラリをシークエンスして、実際の卵母細胞や顆粒膜細胞に対してどの程度の解析深度が達成されるかを解析し、トランスクリプトームと複合した、卵巣中の細胞形態との連関解析を行う。さらに卵巣オルガノイドを用いた動的なモニタリングとの複合解析も進める。

Research Products

• [Journal Article] 10.1073/pnas.2213810120 (2023)
  • Author(s): Generoso, S.F., Neguembor, M.V., Hershberg, E.A., Sadreyev, R.I., Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ricci, R., Audergon, P., Bauer, M., Saitou, M., Hochedlinger, K., Beliveau, B.J., Cosma, M.P., Lee, J.T., Payer, B.
  • Journal Title: Proc Natl Acad Sci U S A Volume: 120 Issue: 4
  • DOI: 10.1073/pnas.2213810120
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] High-quality single-cell transcriptomics from ovarian histological sections during folliculogenesis (2023)
  • Author(s): Ikeda Hiroki、Miyao Shintaro、Nagaoka So、Takashima Tomoya、Law Sze-Ming、Yamamoto Takuya、Kurimoto Kazuki
  • Journal Title: Life Science Alliance Volume: 6 Issue: 11 Pages: e202301929-e202301929
  • DOI: 10.26508/lsa.202301929
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rat post-implantation epiblast-derived pluripotent stem cells produce functional germ cells (2023)
  • Author(s): Iwatsuki Kenyu、Oikawa Mami、Kobayashi Hisato、Penfold Christopher A.、Sanbo Makoto、Yamamoto Takuya、Hochi Shinichi、Kurimoto Kazuki、Hirabayashi Masumi、Kobayashi Toshihiro
  • Journal Title: Cell Reports Methods Volume: 3 Issue: 8 Pages: 100542-100542
  • DOI: 10.1016/j.crmeth.2023.100542
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Conservation and divergence of canonical and non-canonical imprinting in murids (2023)
  • Author(s): Richard Albert Julien、Kobayashi Toshihiro、Inoue Azusa、Monteagudo-S?nchez Ana、Kumamoto Soichiro、Takashima Tomoya、Miura Asuka、Oikawa Mami、Miura Fumihito、Takada Shuji、Hirabayashi Masumi、Korthauer Keegan、Kurimoto Kazuki、Greenberg Maxim V. C.、Lorincz Matthew、Kobayashi Hisato
  • Journal Title: Genome Biology Volume: 24 Issue: 1 Pages: 48-48
  • DOI: 10.1186/s13059-023-02869-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Histology-associated transcriptomic heterogeneity in ovarian folliculogenesis revealed by quantitative single-cell RNA-sequencing for tissue sections with DRaqL (2022)
  • Author(s): Ikeda Hiroki、Miyao Shintaro、Nagaoka So、Yamamoto Takuya、Kurimoto Kazuki
  • Journal Title: biorxiv Volume: -
  • DOI: 10.1101/2022.12.14.520513
  • Open Access
• [Journal Article] Functional primordial germ cell?like cells from pluripotent stem cells in rats (2022)
  • Author(s): Oikawa Mami、Kobayashi Hisato、Sanbo Makoto、Mizuno Naoaki、Iwatsuki Kenyu、Takashima Tomoya、Yamauchi Keiko、Yoshida Fumika、Yamamoto Takuya、Shinohara Takashi、Nakauchi Hiromitsu、Kurimoto Kazuki、Hirabayashi Masumi、Kobayashi Toshihiro
  • Journal Title: Science Volume: 376 Issue: 6589 Pages: 176-179
  • DOI: 10.1126/science.abl4412
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Reconstituting oogenesis in vitro: recent progress and future prospects (2021)
  • Author(s): Nagaoka So I.、Saitou Mitinori、Kurimoto Kazuki
  • Journal Title: Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research Volume: 18 Pages: 145-151
  • DOI: 10.1016/j.coemr.2021.03.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epigenome reprogramming in the male and female germ line (2021)
  • Author(s): Kurimoto Kazuki、Ikeda Hiroki、Kobayashi Hisato
  • Journal Title: Epigenetics and Reproductive Health Volume: 21 Pages: 3-25
  • DOI: 10.1016/b978-0-12-819753-0.00001-5
  • ISBN: 9780128197530
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cyclosporin A and FGF signaling support the proliferation/survival of mouse primordial germ cell-like cells in vitro† (2020)
  • Author(s): Ohta Hiroshi、Yabuta Yukihiro、Kurimoto Kazuki、Nakamura Tomonori、Murase Yusuke、Yamamoto Takuya、Saitou Mitinori
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 104 Issue: 2 Pages: 344-360
  • DOI: 10.1093/biolre/ioaa195
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] 始原生殖細胞発生過程におけるDNAメチル化リプログラミング (2020)
  • Author(s): 栗本一基
  • Journal Title: 月刊 細胞 Volume: 52 Pages: 508-511
• [Journal Article] マウス卵母細胞運命決定機構の解明 (2020)
  • Author(s): 長岡 創、栗本一基、斎藤通紀
  • Journal Title: 実験医学 Volume: 38 Pages: 1893-1896
• [Presentation] 生殖細胞形成過程のエピゲノム動態と遺伝子発現の不均一性 (2023)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 環境エピゲノム研究会秋季ネットシンポジウム
  • Invited
• [Presentation] Quantitative single-cell RNA-sequencing for tissue sections with DRaqL; an efficient RNA recovery and cDNA amplification method for laser capture microdissection (2022)
  • Author(s): Kazuki Kurimoto
  • Organizer: The International Symposium “Totipotency and Germ Cell Development "
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Single-cell RNA-sequencing for frozen sections with DRaqL; an efficient RNA recovery and cDNA amplification method for laser capture (2022)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 第127回日本解剖学会年会
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 始原生殖細胞の発生とエピゲノムリプログラミング (2021)
  • Author(s): 栗本一基
  • Organizer: 日本解剖学会総会・全国学術集会・第98回日本生理学会大会
  • Invited
• [Book] 疾患原因遺伝子・タンパク質の解析技術と創薬/診断技術への応用 (2022)
  • Author(s): 栗本一基
  • Total Pages: 13
  • Publisher: 技術情報協会
  • ISBN: 9784861048777
• [Patent(Industrial Property Rights)] 細胞の溶解方法 (2022)
  • Inventor(s): 栗本一基、池田宏輝、宮尾晋太朗
  • Industrial Property Rights Holder: 奈良県立医科大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2021-200053
  • Filing Date: 2022