Reconstitution of Physiologically Relevant 3D Blood-Brain Barrier Model for the Elucidation of its Selective Transport Mechanism

• Project/Area Number: 20H02594
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 28050:Nano/micro-systems-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: オケヨ ケネディオモンディ 京都大学, 医生物学研究所, 講師 (10634652)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 小穴 英廣 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (20314172)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥17,940,000 (Direct Cost: ¥13,800,000、Indirect Cost: ¥4,140,000); Fiscal Year 2022: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2021: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000); Fiscal Year 2020: ¥7,800,000 (Direct Cost: ¥6,000,000、Indirect Cost: ¥1,800,000)
• Keywords: 血液脳関門 / 細胞間相互作用 / 接着環境制御 / 細胞間接着 / 共培養システム / 生体模倣システム / ペリサイト / 血管内皮細胞 / 共培養 / 密着結合 / アストロサイト / TEER測定 / 細胞シート / 三次元培養 / マイクロメッシュ培養法 / 細胞接着制御 / 血管細胞シート / 選択的物質輸送 / 経上皮電気抵抗 / ３次元培養 / 脳幹細胞

Outline of Research at the Start

認知症・神経変性疾患・脳血管疾患などの神経疾患の有病率が増大の一途を辿っている．しかし，神経疾患の多くは難治性であり，それらの発症メカニズムが分かっていない．本研究では，脳内環境の恒常性維持を担う血液脳関門（blood-brain barrier，BBB）に着目し，独自技術「マイクロメッシュ培養法」によりその基本構造を再現した３次元体外モデルを構築することで，BBBの選択的物質輸送機構を研究する．

Outline of Annual Research Achievements

血液脳関門(BBB)は，脳内毛細血管の内皮細胞が形成する密着結合からなる強力なバリアであり，血液から脳内への物質通過を極力制限することにより，脳内恒常性維持を担っている。BBBの選択的物質輸送機能はその構成細胞である血管内皮細胞，周皮細胞およびアストロサイトの直接コンタクトを介した相互作用により調節されると考えられているが，これを体外で再現してBBBの機能解明に繋げることがまだ実現されていない。 そこで，本研究では，BBBのバリア機能の仕組みとその調節メカニズム解明に向け，BBBの構成細胞が物理的にコンタクトして相互作用しうる３次元BBBモデルの実現を目指した。そのため，我々が開発したマイクロメッシュ培養法を用い，強固な密着結合が形成された血管内皮細胞シートを作製し、それを生かすアプローチを取った。具体的には，マイクロメッシュ上で血管内皮細胞シートの自己組織化を誘導し，その上に直接周皮細胞を播種することで血管内皮細胞と周皮細胞の共培養構造をまず作製した。次に，マトリゲル包埋のアストロサイトを加えることで脳側の細胞と血管内皮細胞が自由にコンタクトしうる３次元共培養システムを構築した。免疫染色および経内皮電気抵抗法（TEER法）により細胞間結合を経時的に評価した結果，血管内皮細胞シートの形成とその後の成熟過程においてTEER値の上昇が確認され，細胞間結合が時間とともに強化されることが分かった。さらに，３次元システムにおいて，周皮細胞およびアストロサイトがそれぞれ血管内皮細胞シートに接着している様子が確認され，TEER値のさらなる上昇も認められた。これらの結果より，BBBの構成細胞が織りなす直接相互作用がそのバリア能の強化に影響を与えていることが示唆された。今後，本研究で実現したモデルがBBBの選択的物質輸送のメカニズム解明あるいは薬剤スクリーニングに活用されることが期待できる。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] A single-cell surgery microfluidic device for transplanting tumor cytoplasm into dendritic cells without nuclei mixing (2023)
  • Author(s): Kennedy Omondi Okeyo, Ryuta Hiyaji, Hidehiro Oana
  • Journal Title: Biotechnology Journal Volume: 18 Issue: 1 Pages: 2200135-2200135
  • DOI: 10.1002/biot.202200135
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Pluripotency state of mouse ES cells determines their contribution to self-organized layer formation by mesh closure on microstructured adhesion-limiting substrates (2022)
  • Author(s): Ando Yuta、Okeyo Kennedy Omondi、Adachi Taiji
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 590 Pages: 97-102
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.12.066
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Study of transmembrane ion transport under tonicity imbalance using a combination of low frequency-electrical impedance spectroscopy (LF-EIS) and improved ion transport model (2022)
  • Author(s): Li Songshi、Kawashima Daisuke、Sugawara Michiko、Obara Hiromichi、Okeyo Kennedy Omondi、Takei Masahiro
  • Journal Title: Biomedical Physics & Engineering Express Volume: - Issue: 3 Pages: 035024-035024
  • DOI: 10.1088/2057-1976/ac5fc5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Assessment of anisotropic transmembrane transport coefficient vector of cell-spheroid under inhomogeneous ion concentration distribution fields by electrical impedance tomography (2022)
  • Author(s): Li Songshi、Kawashima Daisuke、Okeyo Kennedy Omondi、Murata Takeshi、Takei Masahiro
  • Journal Title: Measurement Science and Technology Volume: 34 Issue: 3 Pages: 035701-035701
  • DOI: 10.1088/1361-6501/acaa4a
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 培養基板の剛性異方性による細胞配向誘導とその応用可能性 (2022)
  • Author(s): オケヨ ケネディ
  • Organizer: TLO京都・大学発シーズ マッチングセミナー
  • Invited
• [Presentation] A Triculture Model of the Blood-Brain Barrier for Assessing the Effect of Cell-Cell Interactions on Barrier Integrity (2022)
  • Author(s): Kennedy O. Okeyo
  • Organizer: The 17th International Conference on Nano/Micro Engineered and Molecular Systems (NEMS)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Instructive Cell Adhesion Microenvironment Direct Self-organization and Differentiation of Stem Cells (2020)
  • Author(s): Kennedy O. Okeyo, Yuta Ando, and Taiji Adachi
  • Organizer: The 24th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (μTAS2020), ONLINE
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] マイクロメッシュによる細胞接着空間制御に基づく血管内皮細胞シートの作製とそのバリア機能の評価 (2020)
  • Author(s): 玉井龍太郎，オケヨ・ケネディ・オモンディ，安達泰治
  • Organizer: 第59回日本生体医工学会大会, オンライン開催
• [Presentation] マイクロメッシュ培養技術を用いたヒトiPS 細胞 から栄養外胚葉様細胞への分化誘導技術の開発 (2020)
  • Author(s): 新見夕姫，田邉麻衣子，大山国夫，半澤宏子，オケヨ・ケネディ・オモンディ，武田志津
  • Organizer: 第19回日本再生医療学会総会, 岡山 オンライン開催
• [Presentation] 単一細胞同定のためのノイズ除去電気インピーダンス分光法（neEIS）システム (2020)
  • Author(s): [10]Tran Anh Kiet, Daisuke Kawashima, Michiko Sugarawa, Hiromichi Obara, Kennedy O. Okeyo, Masahiro Takei
  • Organizer: 日本機械学会第31回バイオフロンティア講演会, #1A14, 上田 オンライン開催
• [Patent(Industrial Property Rights)] 構造体，細胞培養装置，配向した細胞シートならびに配向した細胞シート形成を誘導する方法 (2020)
  • Inventor(s): 安達泰治，オケヨ・ケネディ
  • Industrial Property Rights Holder: 安達泰治，オケヨ・ケネディ
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020