Cell biological study for the distribution and dynamic of lipid in the biological membrane with nano-scale analyzing techniques

• Project/Area Number: 20H03154
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 正谷 達謄 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (70614072)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2022: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000); Fiscal Year 2021: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2020: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
• Keywords: 電子顕微鏡 / ナノスケール / 脂質 / 微細局在 / 凍結割断レプリカ法 / オートファジー / イノシトールリン酸 / フリーズフラクチャー / 微細構造 / 生体膜 / 急速凍結

Outline of Research at the Start

分子生物学の飛躍的発展とそれに基づくゲノミクス、プロテオミクスの展開により、DNA・RNAと蛋白質についての知見は急速に増加している。生体膜についても膜蛋白質に関する研究は高度化し、多くの知見が集積されている。しかし膜脂質に関しては有力な解析技術が少ないため、まだまだ未知の点が多く残されている。本研究では、申請者らが開発した急速凍結・凍結割断レプリカ標識法をさらに発展・改良することにより、生体膜脂質の分布・動態をナノスケールレベルで明らかにし、新たなライフ・イノベーションの創出を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

細胞の自食作用（オートファジー）の内、特徴的な二重膜構造であるオートファゴソームを形成するマクロオートファジーにおいては、種々の遺伝的解析の結果、複数のオートファジー関連蛋白質(Atg)とその働きが解明されており、分子メカニズムの総合的な理解が進んでいる。しかしながらオートファゴソームの形成機序については不明な点がまだまだ多い。研究代表者らは現在までの検討により、酵母細胞においてオートファゴソームの形成にホスファチジルイノシトール4リン酸（PtdIns(4)P）の産生に関与するPI4キナーゼのPik1pが重要な役割を担っていることを解明した。また、PtdIns(4)Pはオートファゴソームの二重膜の内膜および外膜の管腔側のリーフレット（EF）に局在することを明らかにした。本研究ではPtdIns(4)Pの脱リン酸化するSac1pとSjl3pについてオートファゴソームの形成機序における関与を検討した。オートファジー活性を測定したところ、Sac1pとSjl3pの両方の活性を抑制した時のみオートファジーが抑制されていることを見出した。また、急速凍結割断レプリカ法を用いてオートファゴソームの構造を観察したところ、Sac1pとSjl3pの両方の活性を抑制した酵母細胞では、オートファゴソームが観察できなかった。そして、急速凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法によりPtdIns(4)Pを標識したところ、Sac1pあるいはSjl3pのどちらかを抑制した酵母細胞では、オートファゴソームの内膜および外膜ともに細胞質側のリーフレット（PF）にもPtdIns(4)Pが局在することがわかった。以上のことより、オートファゴソームの形成には、Pik1pによるPtdIns(4)Pの産生とSac1pとSjl3pによるPtdIns(4)Pの脱リン酸化の回転が正常に進むことが重要であることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ホスファチジルイノシトール4リン酸（PtdIns(4)P）に対するプローブを作成し、新たにPtdIns(4)Pを標識する方法を確立できた。その結果、オートファジーにおけるPtdIns(4)Pの脱リン酸化酵素の役割を検討し、新しいオートファジーの調節機構を解明することができた。

Strategy for Future Research Activity

ホスファチジルセリンやPtdIns(3,5)P2など、その他のリン脂質に対するプローブを作成することによりオートファジー、アポトーシスなどの細胞機能と脂質代謝異常疾患の関係を解析する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Essential roles of phosphatidylinositol 4-phosphate phosphatases Sac1p and Sjl3p in yeast autophagosome formation (2022)
  • Author(s): Muramoto Moe、Yamakuchi Yuki、Konishi Rikako、Koudatsu Shiomi、Tomikura Hiromu、Fukuda Kayoko、Kuriyama Sayuri、Kurokawa Yuna、Masatani Tatsunori、Tamaki Hisanori、Fujita Akikazu
  • Journal Title: Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids Volume: 1867 Issue: 9 Pages: 159184-159184
  • DOI: 10.1016/j.bbalip.2022.159184
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Selective increment of phosphatidylserine on the autophagic body membrane in yeast’s vacuole. (2021)
  • Author(s): Yamakuchi, Y., Kurokawa, Y., Konishi, R., Fukuda, K., Masatani, T., Fujita, A.
  • Journal Title: FEBS Lett. Volume: 595 Issue: 17 Pages: 2197-2207
  • DOI: 10.1002/1873-3468.14167
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Glycosphingolipid GM3 is localized in both exoplasmic and cytoplasmic leaflets of Plasmodium falciparum malaria parasite plasma membrane (2021)
  • Author(s): Shiomi Koudatsu, Tatsunori Masatani, Rikako Konishi, Masahito Asada, Hassan Hakimi, Yuna Kurokawa, Kanna Tomioku, Osamu Kaneko & Akikazu Fujita
  • Journal Title: Scientific reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 14890-14890
  • DOI: 10.1038/s41598-021-94037-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The distribution of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the budding yeast plasma membrane. (2021)
  • Author(s): Kurokawa, Y., Konishi, R., Yoshida, A., Tomioku, K., Tanabe, K., Fujita, A.
  • Journal Title: Histochem. Cell Biol. Volume: 156 Issue: 2 Pages: 109-121
  • DOI: 10.1007/s00418-021-01989-8
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Raft microdomain localized in the luminal leaflet of inner membrane complex of living Toxoplasma gondii (2021)
  • Author(s): Konishi R et al.
  • Journal Title: Eur J Cell Biol Volume: 100 Issue: 2 Pages: 151149-151149
  • DOI: 10.1016/j.ejcb.2020.151149
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 酵母細胞でのオートファジーにおけるオートファジックボディーの選択的崩壊機構とオートファジックボディー膜におけるホスファチジルセリンの選択的増加 (2022)
  • Author(s): 山口優希、黒川夕奈、向達汐美、福田佳代子、正谷達謄、藤田秋一
  • Organizer: 第96回 日本生化学大会
• [Presentation] ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumでのラフト主成分の糖脂質GM3の局在 (2022)
  • Author(s): 向達 汐美, 正谷 達謄, 小西 里可子, 黒川 夕奈, 山口 優希, 富奥 甘奈, 福田 佳代子, ハキミ ハッサン, 麻田 正仁, 金子 修, 藤田 秋一
  • Organizer: 第96回 日本生化学大会
• [Presentation] 酵母細胞でのautophagosome膜およびautophagic body膜における膜脂質の微細分布解析 (2021)
  • Author(s): 山口優希、黒川夕奈、向達汐美、福田佳代子、正谷達謄、藤田秋一
  • Organizer: 第94回 日本生化学大会
• [Presentation] ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumの細胞膜ではラフト主成分の糖脂質GM3は内葉と外葉の両方に局在する (2021)
  • Author(s): 向達汐美、正谷達謄、小西里可子、黒川夕奈、山口優希、富奥甘奈、福田佳代子、Hakimi Hassan、麻田正仁、金子修、藤田秋一
  • Organizer: 第94回 日本生化学大会
• [Presentation] 急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法を用いた酵母細胞膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-二リン酸（PI(4,5)P2）の局在解析による、PI(4,5)P2生成の制御機構の解明 (2021)
  • Author(s): 黒川夕奈、小西里可子、富奥甘奈、藤田秋一
  • Organizer: 第94回 日本生化学大会
• [Remarks] 鹿児島大学 共同獣医学部 分子細胞生物学 藤田秋一研究室
  • URL: https://www.facebook.com/profile.php?id=100057246648140