全能性状態の誘導による人工的動物個体作製法の開発

• Project/Area Number: 20H03174
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 堀江 恭二 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (30333446)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥17,810,000 (Direct Cost: ¥13,700,000、Indirect Cost: ¥4,110,000); Fiscal Year 2023: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2021: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2020: ¥6,110,000 (Direct Cost: ¥4,700,000、Indirect Cost: ¥1,410,000)
• Keywords: 全能性 / 多能性 / ES細胞 / iPS細胞 / マウス

Outline of Research at the Start

本研究では、マウスES細胞から全能性細胞を誘導して、そこから人工的な初期胚を作製し、最終的には全発生過程を人工的に再現することを目指す。応募者はこれまで、マウスES細胞が多能性状態と全能性状態の間を揺らいでいることを明らかにした。さらに、各状態を規定する転写因子セットを同定する方法を確立し、転写因子セットの発現レベルの操作によってES細胞の状態を遷移させることに成功している。本研究では、この方法を発展させることで、真の全能性状態を誘導し、そこからの分化誘導によって、交配に依存しない動物個体作製法を確立する。

Outline of Annual Research Achievements

動物個体における遺伝子改変は、遺伝子機能を解明するための手法として、医学・生命科学の発展に必須の技術となっている。近年のCRISPRシステムの到来に より、ほとんどすべての動物で、受精卵での遺伝子改変を簡便に遂行できるようになり、動物実験の重要性がさらに高まってきた。ところが、このことは同時 に、過去に例を見ないほどの動物実験の急増を招き、多くの研究機関において、飼育動物数が許容量の限界に達している。この状況を解決するための方策とし て、本研究では、マウスES細胞から全能性状態を誘導し、そこから人工的初期胚を作製し、個体発生を再現することを目指している。
全能性状態を評価する際には、一般的に、マウスES細胞の集塊から胚盤胞様構造を誘導する効率を指標に用いる。その際に、胚盤胞様構造の形成を、形態のみではなく、遺伝子発現の点からも簡便かつ確実に評価できることが望ましい。そこで、胚盤胞を構成する胚盤葉上層、栄養外胚葉の各々で特異的に発現する遺伝子に対して、異なる蛍光蛋白質を、両者共にノックインしたマウスES細胞株を作製した。このES細胞株を栄養外胚葉へ分化誘導することにより、胚盤葉上層と栄養外胚葉にノックインした蛍光蛋白が、想定通り、各々、低下、上昇することを確認した。さらに、全能性状態の２細胞期胚において高発現するMERVLレトロトランスポゾンのLTRに蛍光蛋白を連結したベクターを作製し、上記ES細胞へ導入した。ES細胞においては、1%前後の細胞においてMERVLの発現が一過性に亢進することが報告されているが、それと同様の結果が得られた。以上より、全能性状態から胚盤胞形成に至る過程を蛍光蛋白で可視化する細胞株を樹立できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

３つの蛍光蛋白を導入したES細胞株を樹立でき、今後の研究が加速化すると期待できる状況にある。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究で、全能性状態から胚盤胞に至る過程を、蛍光蛋白で可視化できるマウスES細胞を樹立できた。今後は、ES細胞からの全能性状態への移行を、種々の培養条件や転写因子の一過的な強制発現などにより試みることを計画している。転写因子については、種々のRNA-seqのデータから、候補の選定を終えており、次年度に速やかに遂行できる状況にある。

Research Products

• [Journal Article] Mutation of the SWI/SNF complex component Smarce1 decreases nucleosome stability in embryonic stem cells and impairs differentiation (2024)
  • Author(s): Kashiwagi Katsunobu、Yoshida Junko、Kimura Hiroshi、Shinjo Keiko、Kondo Yutaka、Horie Kyoji
  • Journal Title: Journal of Cell Science Volume: 137 Issue: 6
  • DOI: 10.1242/jcs.260467
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Long-read sequence analysis of MMEJ-mediated CRISPR genome editing reveals complex on-target vector insertions that may escape standard PCR-based quality control (2023)
  • Author(s): Yuki Higashitani, Kyoji Horie
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 13 Issue: 1 Pages: 11652-11652
  • DOI: 10.1038/s41598-023-38397-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Comparison of CRISPR/Cas9-mediated megabase-scale genome deletion methods in mouse embryonic stem cells (2023)
  • Author(s): Masayuki Miyata, Junko Yoshida, Itsuki Takagishi, Kyoji Horie
  • Journal Title: DNA Research Volume: 30 Issue: 1
  • DOI: 10.1093/dnares/dsac045
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Long-read sequencingで判明したゲノム編集において見逃されうるon-targetでのベクター挿入様式 (2023)
  • Author(s): 東谷優輝、堀江恭二
  • Organizer: 第8回日本ゲノム編集学会
• [Presentation] Inhibition of N-myristoyltransferase promotes naive pluripotency in mouse and human pluripotent stem cells (2022)
  • Author(s): Kyoji Horie
  • Organizer: International Society for Stem Cell Research 2022 Annual Meeting
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] N-myristoyltransferaseの阻害によるマウス及びヒト多能性幹細胞のナイーブ性の亢進 (2022)
  • Author(s): 堀江恭二
  • Organizer: 第99回日本生理学会大会
• [Presentation] N-myristoyltransferaseの阻害によるマウス及びヒト多能性幹細胞のナイーブ性の亢進 (2021)
  • Author(s): 吉田純子, 渡邊仁美, 山内香織, 西久保拓真, 磯谷綾子, 大塚哲, 丹羽仁史, 阿久津英憲, 梅澤明弘, 末盛博文, 高島康弘, 近藤玄, 竹田潤二, 堀江恭二
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会