A new view of microangiography with high spatial resolution, high contrast resolution, and high time resolution using synchrotron radiation

Research Project

Project/Area Number	20H03617
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Allocation Type	Single-year Grants
Section	一般
Review Section	Basic Section 52040:Radiological sciences-related
Research Institution	Tsukuba University of Technology
Principal Investigator	松下昌之助筑波技術大学, その他部局等, 名誉教授 (70359579)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	松下訓順天堂大学, 医学部, 准教授 (20407315) 下條信威筑波大学, 医学医療系, 講師 (20462210) 塚田亨筑波大学, 附属病院, 病院助教 (20866850) 酒井俊筑波技術大学, 保健科学部, 教授 (30282362) 平松祐司筑波大学, 医学医療系, 教授 (30302417) 徳永千穂筑波大学, 医学医療系, 講師 (30451701) 坂本裕昭筑波大学, 医学医療系, 准教授 (30611115) 兵藤一行大学共同利用機関法人高エネルギー加速器研究機構, 物質構造科学研究所, 教授 (60201729) 三好浩稔筑波大学, 医学医療系, 講師 (70292547)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000) Fiscal Year 2022: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000) Fiscal Year 2021: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000) Fiscal Year 2020: ¥10,660,000 (Direct Cost: ¥8,200,000、Indirect Cost: ¥2,460,000)
Keywords	放射光 / 血管造影法 / 微小循環 / 腎糸球体 / 癌新生血管 / 血管造影 / 高分解能 / 微小血管 / 微小塞栓
Outline of Research at the Start	放射光血管造影法の受像体に高空間分解能・高濃度分解能・高時間分解能を併せ持つ受像体を導入し、いままでより精密な微小循環画像から形態のみならず、流速、造影剤漏出率などの機能情報を加えた解析を行う。3年間で対象となる領域は、①腎臓の糸球体と細動脈の形態、機能評価、②敗血症性ショック時の骨格筋微小循環、③癌の新生血管の血管評価から得られる個別の癌の特徴、④心筋虚血－再灌流不全（no reflow phenomenon）の視認、⑤肺血管性肺高血圧の早期発見、である。微小血管の可視化による病態の機能評価という新しいコンセプトを検証する。その結果は、新規画像機器の開発に際し、重要なヒントとなることが期待される。
Outline of Annual Research Achievements	本研究の目的は放射光施設で、高性能受像体（ORCA-Lightning）を用いて、血管造影法により下記の5病態の微小血管を可視化することにある。①冠微小血管障害、②腎糸球体血流障害、③肺高血圧、④敗血症と末梢血管循環障害、⑤腫瘍微小環境と血管。しかし、2021年度も新型コロナウイルス感染症の感染継続により、実験にも一部影響を与えた。④の研究分担者が筑波大学救急医学におけるコロナ対応専属医師となり、研究ができなかった。また、③の研究分担者も、大学の転籍にともなう多忙のため、研究ができなかった。そのため2021年度は5領域のうち、①、②、⑤の実験を行った。①では、正常冠動脈造影と、ラットにLPS, IL-6を過剰投与した冠動脈微小血管塞栓モデルで冠動脈造影を行った。②の腎糸球体血流障害実験は、ラットの右腎を30分間虚血と再灌流を行い、対照の左腎（健側）との比較を行った。⑤では、ラット大腸がん腫瘍株（RCN9細胞）を頸静脈より注入し、4週間後に肺動脈造影を行い転移性腫瘍の腫瘍内血管を可視化した。①、②、⑤で撮像された腎臓と肺の摘出標本は病理スライドとし、また、冷凍保存した。⑤の冷凍保存標本では腫瘍細胞の遺伝子にあらかじめ挿入されたGFP蛋白質の検出を免疫蛍光染色で行い、腫瘍細胞の肺内での分布を確認した。また放射光画像上では、腫瘍内の微小血管が血管径30μmまで可視化可能であった。一方、呼吸や心拍動によって狭い視野を移動する臓器（心臓、肺、腎臓）の画像鮮明化に関し、薬物と人工呼吸器の操作を用いた一時的な呼吸停止、心拍の徐拍化を行った。その結果、心臓、腎臓、腫瘍血管の撮像において満足できる画像取得プロトコールがほぼ確立された。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 2021年度も、「研究実績の概要」で述べたとおり、新型コロナウイルス感染症の継続に伴って、その影響を一部受けた。また、KEK実験予定日近傍で研究者の体調不良が２名発生し、一時期影響を受けざるを得なかった。研究の対象は下記の５テーマである。①冠微小血管障害、②腎糸球体血流障害、③肺高血圧、④敗血症と末梢血管循環障害、⑤腫瘍微小環境と血管。研究は、2021年度は上記の理由で、①冠微小血管障害、②腎糸球体血流障害、⑤腫瘍微小環境と血管の3領域で実施された。実験動物にはいずれもWistar rat (male)を用いた。撮像系は、線源として放射光由来単色X線を用いた。受像体は高性能のCMOS（ORCA-Lightning：浜松ホトニクス）を用いた。造影剤は非イオン性の30%ヨード液を用いた。自動注入器により2 ml/secの容量で、対象の臓器灌流に応じて、頸動脈、腹部大動脈もしくは頸静脈より注入した。 ①の冠動脈造影では、正常ラットに対して冠動脈造影を行い、狭い視野で有効な冠動脈を撮像できるpositioningを確立した。また、冠微小血栓がLPSとIL-6により発生しうることを病理学的に確認し、また、それに対応する冠微小血管画像を取得することができた。 ②の腎糸球体の血流障害では、右側腎血流を30分遮断して再灌流を行った。対照の左腎と比較を行った。腎臓の静止化により両側腎臓（患側、健側）の１糸球体レベルで同時撮影が可能であることを確認した。⑤では、大腸がん由来の腫瘍細胞（RCN9：1×10^6/匹）を投与し、4週間後に放射光肺動脈造影を行った。腫瘍内に腫瘍内微小血管を確認することができた。血管径50～80μmの腫瘍内血管の本数を腫瘍内血管密度として計測できることが判明した。
Strategy for Future Research Activity	高性能受像体（CMOS：ORCA-Lightning、浜松ホトニクス）を用いた放射光血管造影を前述の５つの領域で実施する。新型コロナウイルス感染症が未だ収束していないが、重症症例は減少傾向にあるため、④敗血症と末梢血管循環障害の研究分担者も高エネルギー加速器研究機構での研究に参加できるようになることが期待される。それにより、できる限りすべての研究分野で、空間分解能、濃度分解能、時間分解能に優れた機能を有するORCA-Lightningを用いた微小血管の造影を実施したい。この５つの領域で微小血管における病態を明らかにすることが研究の目的である。領域を再掲すると以下である。①冠微小血管障害、②腎糸球体血流障害、③肺高血圧、④骨格筋、腎末梢血管循環と敗血症、⑤腫瘍微小環境と血管。コロナウイルス感染症で問題となった微小血栓の再現は、LPSとIL-6の同時使用で可能になったことをふまえ、その可視化と臨床的意義を示すことができるようにしたい。