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Analysis of stemness, aging and carcinogenesis using hematopoietic stem cell ex vivo amplification system

Research Project

Project/Area Number 20H05695
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (S)

Allocation TypeSingle-year Grants
Review Section Broad Section I
Research InstitutionTokyo Medical and Dental University (2022-2024)
The University of Tokyo (2020-2021)

Principal Investigator

中内 啓光  東京医科歯科大学, 高等研究院, 特別栄誉教授 (40175485)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 水野 直彬  東京医科歯科大学, 統合研究機構, 助教 (30815642)
岩間 厚志  東京大学, 医科学研究所, 教授 (70244126)
Project Period (FY) 2020-08-31 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2024)
Budget Amount *help
¥198,380,000 (Direct Cost: ¥152,600,000、Indirect Cost: ¥45,780,000)
Fiscal Year 2024: ¥24,570,000 (Direct Cost: ¥18,900,000、Indirect Cost: ¥5,670,000)
Fiscal Year 2023: ¥29,510,000 (Direct Cost: ¥22,700,000、Indirect Cost: ¥6,810,000)
Fiscal Year 2022: ¥36,140,000 (Direct Cost: ¥27,800,000、Indirect Cost: ¥8,340,000)
Fiscal Year 2021: ¥45,630,000 (Direct Cost: ¥35,100,000、Indirect Cost: ¥10,530,000)
Fiscal Year 2020: ¥62,530,000 (Direct Cost: ¥48,100,000、Indirect Cost: ¥14,430,000)
Keywords造血幹細胞 / 加齢 / 発癌 / 体外増幅 / ex vivo増幅 / クローナル造血 / CRISPRgRNAスクリーニング
Outline of Research at the Start

ごく最近、我々はマウス造血幹細胞をin vitroで長期培養して幹細胞としての機能を維持したまま4週間で900倍以上に増殖させる手法を開発し報告した(Wilkinson et al. Nature, 2019)。
本研究では我々が開発した造血幹細胞の長期培養増殖法を用いて、これまで得られる数が少なかったため難しかった造血幹細胞を対象とした網羅的遺伝子ノックアウトスクリーニングや長期培養後のゲノム変異解析を試み、造血幹細胞の分化と自己複製機構ならびに加齢による血液腫瘍の発症機構の解明に迫る。
さらにヒト造血幹細胞のex vivo増殖を可能にする培養法を確立し、血液学のHolly Grailを達成することを目指す。

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究成果として、長期培養後のマウス造血幹細胞の骨髄再構築能と相関する細胞表面マーカーを同定した。また、本培養法において5% O2の低酸素条件下では機能的な造血幹細胞分画がさらに高度に濃縮されることがわかったが、酸素濃度を1%まで低下させた条件で培養した造血幹細胞の骨髄再構築能は、5% O2条件下で培養した群と比較して低いことが判明した。これらのことから、造血幹細胞の長期培養増幅に最適な酸素濃度は5%であることを確認した。現在は本培養で用いる培地の特性を評価するため、長期培養後に認める造血幹細胞分画以外の細胞集団についてその表現型や生体内での機能解析を行っている。また、マウス造血幹細胞の長期培養と遺伝子変異の集積を経時的に評価し、長期の造血幹細胞の培養が遺伝子変異の蓄積と相関することをwhole exon sequencingを用いて明らかにした。
ヒト造血幹細胞の増幅培養に関しては、caprolactam-based polymer、740Y-P (a PI3K activator)、butyzamide (THPO receptor agonists)を組み合わせる事で無血清増幅培養を達成した(Sakurai, Yamazaki, Nakauchi et al., Nature, 2023)。この手法では、マウスPVA培地による培養と異なり、サイトカインSCF/TPOをpeptide/化合物へ置換する事で、安定して2週間、最長で一か月の体外培養増幅を可能とした。
現在は臍帯血ロット間で造血幹・前駆細胞分画の増幅率に影響を与える因子の解析を行いつつ、マウス造血幹細胞培養で重要な因子であった酸素濃度の影響を調べている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究において最重要の課題であったヒト造血幹細胞培養に関しては、従来の血清培養から合成ポリマーとpeptide、化合物によるchemically defined mediumによる培養法を確立し、既報の培養法と同等以上の期間、増幅培養を続ける事に成功した。
当該培養法では、使用する臍帯血のロットによる培養効率差が激しいという問題があるが、これまでの研究成果から候補となる要因を抽出済みであり、検証を進めている。
また、本培養法をベースに、造血器悪性腫瘍や造血系加齢性変化をin vitroで再現する研究も進行中である。既にいくつかの遺伝子破壊により表現型変化を確認できている。

Strategy for Future Research Activity

最終年度である本年度は、既報とこれまでのスクリーニング結果から候補として挙げられた遺伝子群のゲノム編集により、実際の造血幹細胞性に影響が出るか、また加齢性変化を十分に再現できているか、マウスへの移植によりin vivoで確認する。
また、PVA培地によるマウス造血幹細胞体外培養増幅と比較して、2023年に発表したヒト造血幹前駆細胞培養に用いる合成ポリマーをベースとしたchemically defined mediumでは極端に試行群による差があった。この要因としては臍帯血ロット差の影響が最も大きいと考えられ、表面マーカーによる特異分画の多少による品質判定や低酸素培養等による活性酸素の影響低減などの評価を通じて、体外増幅培養期間の延長と安定化、増幅効率上昇を行う。

Assessment Rating
Interim Assessment Comments (Rating)

A: In light of the aim of introducing the research area into the research categories, the expected progress has been made in research.

Report

(7 results)
  • 2023 Annual Research Report
  • 2022 Abstract (Interim Assessment) ( PDF )   Annual Research Report   Interim Assessment (Comments) ( PDF )
  • 2020 Abstract ( PDF )   Comments on the Screening Results ( PDF )   Annual Research Report
  • Research Products

    (17 results)

All 2024 2023 2022 2021 2020

All Journal Article (8 results) (of which Int'l Joint Research: 8 results,  Peer Reviewed: 8 results,  Open Access: 6 results) Presentation (9 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Invited: 8 results)

  • [Journal Article] Chemically defined cytokine-free expansion of human haematopoietic stem cells2023

    • Author(s)
      Sakurai Masatoshi、Ishitsuka Kantaro、Ito Ryoji、Wilkinson Adam C.、Kimura Takaharu、Mizutani Eiji、Nishikii Hidekazu、Sudo Kazuhiro、Becker Hans Jiro、Takemoto Hiroshi、Sano Tsubasa、Kataoka Keisuke、Takahashi Satoshi、Nakamura Yukio、Kent David G et al.
    • Journal Title

      Nature

      Volume: 615 Issue: 7950 Pages: 127-133

    • DOI

      10.1038/s41586-023-05739-9

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Physioxia improves the selectivity of hematopoietic stem cell expansion cultures2023

    • Author(s)
      Igarashi Kyomi J.、Kucinski Iwo、Chan Yan Yi、Tan Tze-Kai、Khoo Hwei Minn、Kealy David、Bhadury Joydeep、Hsu Ian、Ho Pui Yan、Niizuma Kouta、Hickey John W.、Nolan Garry P.、Bridge Katherine S.、Czechowicz Agnieszka、Gottgens Berthold、Nakauchi Hiromitsu、Wilkinson Adam C.
    • Journal Title

      Blood Advances

      Volume: 7 Issue: 14 Pages: 3366-3377

    • DOI

      10.1182/bloodadvances.2023009668

    • Related Report
      2023 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells2022

    • Author(s)
      Che James L C、Bode Daniel、Kucinski Iwo、Cull Alyssa H、Bain Fiona、Becker Hans J、Jassinskaja Maria、Barile Melania、Boyd Grace、Belmonte Miriam et al.
    • Journal Title

      EMBO reports

      Volume: 23 Issue: 10

    • DOI

      10.15252/embr.202255502

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Streamlined and quantitative detection of chimerism using digital PCR2022

    • Author(s)
      Suchy Fabian P.、Nishimura Toshiya、Seki Shinsuke、Wilkinson Adam C.、Higuchi Maimi、Hsu Ian、Zhang Jinyu、Bhadury Joydeep、Nakauchi Hiromitsu
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 12 Issue: 1 Pages: 10233-10233

    • DOI

      10.1038/s41598-022-14467-5

    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice2021

    • Author(s)
      Wilkinson AC, Dever DP, Baik R, Camarena J, Hsu I, Charlesworth CT, Morita C, Nakauchi H, Porteus MH.
    • Journal Title

      Nat Commun

      Volume: 1 Issue: 1 Pages: 686-686

    • DOI

      10.1038/s41467-021-20909-x

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] In vivo and ex vivo haematopoietic stem cell expansion2020

    • Author(s)
      Yamamoto Ryo、Wilkinson Adam C.、Nakauchi Hiromitsu
    • Journal Title

      Current Opinion in Hematology

      Volume: 27 Issue: 4 Pages: 273-278

    • DOI

      10.1097/moh.0000000000000593

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.2020

    • Author(s)
      Wilkinson AC, Igarashi KJ, Nakauchi H.
    • Journal Title

      Nat Rev Genet.

      Volume: 21 Issue: 9 Pages: 541-554

    • DOI

      10.1038/s41576-020-0241-0

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro.2020

    • Author(s)
      Wilkinson AC, Nakauchi H.
    • Journal Title

      Curr Opin Genet Dev.

      Volume: 64 Pages: 1-5

    • DOI

      10.1016/j.gde.2020.05.035

    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] ポリマーを用いたヒト臍帯血CD34+細胞の長期培養増幅における酸素濃度の影響2024

    • Author(s)
      岡部 基人、水野 直彬、中内 啓光
    • Organizer
      第46回 日本造血・免疫細胞療法学会総会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] Stem cell research and the next generation of transplantation medicine2022

    • Author(s)
      中内 啓光
    • Organizer
      国際移植学会アジアシンポジウム
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 幹細胞研究から次世代の医療へ:大学から産業界へ2022

    • Author(s)
      中内 啓光
    • Organizer
      筑波大学講義: "Translating Stem Cell Research: From academia to industry”
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 異種移植の今後の展望 基礎科学の進歩が切り開く新しい移植医療2022

    • Author(s)
      中内 啓光
    • Organizer
      日本移植学会総会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 幹細胞研究から臨床へのトランスレーションを目指して2022

    • Author(s)
      中内 啓光
    • Organizer
      JACI主催勉強会
    • Related Report
      2022 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] Ex vivo expansion of HSCs: towards a holy grail in hematology2021

    • Author(s)
      Hiromitsu Nakauchi
    • Organizer
      Stanford University School of Medicine / 5th Annual Center for Definitive and Curative Medicine (CDCM) Virtual Symposium
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 幹細胞研究から未来の医療へ2020

    • Author(s)
      中内啓光
    • Organizer
      第 27 回日本輸血・細胞治療学会秋季シンポジウム
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 幹細胞研究から臨床へのトランスレーションを目指して2020

    • Author(s)
      中内啓光
    • Organizer
      第69回共済医学会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Invited
  • [Presentation] 幹細胞研究から新しい医療へ2020

    • Author(s)
      中内啓光
    • Organizer
      日本口腔外科学会総会
    • Related Report
      2020 Annual Research Report
    • Invited

URL: 

Published: 2020-09-07   Modified: 2024-12-25  

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