べん毛モーター固定子の構造変化により生じるエネルギー変換機構の解明

• Project/Area Number: 20J00329
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 錦野 達郎 大阪大学, 大阪大学蛋白質研究所, 特別研究員(PD) (80884428)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: Sodium channel / Bacterial flagellum / Energy conversion / Flagellar stator / PomAPomB / Solution NMR / Cryo-EM / Single particle analysis / 細菌べん毛モーター / 固定子 / エネルギー変換 / クライオ電子顕微鏡 / 単粒子解析 / 溶液NMR / イオンチャネル / べん毛モーター / 固定子複合体 / 回転子 / FliG

Outline of Research at the Start

細菌のべん毛モーターは、「回転子」と「固定子」と呼ばれるタンパク質複合体が相互作用することで、膜内外に形成される電気化学ポテンシャルを運動エネルギーに変換し回転する。このエネルギー変換の分子機構の理解には、回転子固定子間相互作用を明らかにする必要があるが、PomA, PomBからなり、イオンチャネルとして働く固定子は、複合体での精製が困難な膜蛋白質であるためその構造が明らかでない。近年、固定子複合体を高い純度で再現性よく精製する方法が確立されたことから、申請者は核磁気共鳴法、単粒子解析法等の構造解析学的手法により、固定子複合体の動的な構造変化の解明とエネルギー変換の分子機構の理解を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

細菌の運動器官の一つであるべん毛は、回転するモーターをもつ超分子複合体である。モーターは自身が回転する「回転子」と回転子の周りに集合しイオンチャネルとして機能する「固定子」の2種類の複合体から成る。モーターの回転は、固定子への共役イオンの流入とカップルした回転子と固定子の相互作用により、膜内外に形成される電気化学ポテンシャルが運動エネルギーに変換されることで生じる。固定子は、5分子のA(PomA)と2分子のB(PomB)のサブユニットからなる膜貫通タンパク質複合体である。その構造はクライオ条件下での単粒子解析により明らかになっているが、エネルギー変換の際の複合体の構造変化や共役イオンの通り道は未だによくわかっていない。本研究では、これらを明らかにするため、クライオ条件での単粒子解析と溶液核磁気共鳴法(NMR)によりにNa+チャネルである海洋性ビブリオ菌の固定子複合体[PomAPomB]の構造情報を取得と、申請者のこれらの手法の習熟を目的としていた。
3年間の研究により、単粒子解析では、複合体の近原子分解能のクライオマップを構築し、モデル構造の構築と精密化ができた。溶液NMRでの解析では、複合体試料の測定を行ったところ、Na+濃度に依存したスペクトルの変化が見られた。これらの結果を基にして、共役イオンが固定子複合体をどのように通ることにより、回転子を回転させるのかに関して論文の執筆を進めている。これらの成果から、申請者はクライオ条件での単粒子解析と溶液NMRによる構造解析技術を習得できた。
また関連した研究として、高度好熱菌の固定子Aサブユニット(MotA)複合体の単粒子解析では、MotAのみで5量体を形成する内容を論文にまとめ、受理された。回転子を構成するタンパク質の一つであるFliGの溶液NMR解析の内容は論文を投稿し、リバイスが帰ってきており対応を進めている。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structure of MotA, a flagellar stator protein, from hyperthermophile (2023)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Norihiro Takekawa, Duy Phuoc Tran, Jun-ichi Kishikawa, Mika Hirose, Sakura Onoe, Seiji Kojima, Michio Homma, Akio Kitao, Takayuki Kato and Katsumi Imada
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 631 Pages: 78-85
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.09.072
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Function and Structure of FlaK, a Master Regulator of the Polar Flagellar Genes in MarineVibrio. (2022)
  • Author(s): Michio Homma,Tomoya Kobayakawa,Yuxi Hao,Tatsuro Nishikino,Seiji Kojima.
  • Journal Title: J Bacteriol. Volume: 204(11) Issue: 11
  • DOI: 10.1128/jb.00320-22
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Hoop-like role of the cytosolic interface helix in Vibrio PomA, an ion-conducting membrane protein, in the bacterial flagellar motor (2022)
  • Author(s): Nishikino T, Sagara Y, Terashima H, Homma M, Kojima S.
  • Journal Title: J Biochem. Volume: 171(4) Issue: 4 Pages: 443-450
  • DOI: 10.1093/jb/mvac001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A slight bending of an α-helix in FliM creates a counterclockwise-locked structure of the flagellar motor in <i>Vibrio</i> (2021)
  • Author(s): Takekawa Norihiro、Nishikino Tatsuro、Yamashita Toshiki、Hori Kiyoshiro、Onoue Yasuhiro、Ihara Kunio、Kojima Seiji、Homma Michio、Imada Katsumi
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 170 Issue: 4 Pages: 531-538
  • DOI: 10.1093/jb/mvab074
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] ZomB is essential for chemotaxis of Vibrio alginolyticus by the rotational direction control of the polar flagellar motor (2021)
  • Author(s): Takekawa N, Nishikino T, Hori K, Kojima S, Imada K, Homma M.
  • Journal Title: Genes Cells. Volume: 26(11) Issue: 11 Pages: 927-937
  • DOI: 10.1111/gtc.12895
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Achievements in bacterial flagellar research with focus on Vibrio species (2021)
  • Author(s): Michio Homma, Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima.
  • Journal Title: Microbiol Immunol. Volume: 66(2) Issue: 2 Pages: 75-95
  • DOI: 10.1111/1348-0421.12954
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] The flagellar motor of Vibrio alginolyticus undergoes major structural remodeling during rotational switching (2020)
  • Author(s): Carroll Brittany L、Nishikino Tatsuro、Guo Wangbiao、Zhu Shiwei、Kojima Seiji、Homma Michio、Liu Jun
  • Journal Title: eLife Volume: 9
  • DOI: 10.7554/elife.61446
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Flagellar related genes and functions in <i>Vibrio</i> (2020)
  • Author(s): NISHIKINO Tatsuro、KOJIMA Seiji、HOMMA Michio
  • Journal Title: Nippon Saikingaku Zasshi Volume: 75 Issue: 3 Pages: 195-214
  • DOI: 10.3412/jsb.75.195
  • NAID: 130007961760
  • ISSN: 0021-4930, 1882-4110
  • Peer Reviewed
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡単粒子解析による海洋性ビブリオ菌のNa+駆動型PomAPomB固定子のイオン透過経路の解明 (2023)
  • Author(s): 〇錦野達郎、竹川宜宏、岸川淳一、廣瀬未果、小嶋誠司、本間道夫、加藤貴之、今田勝巳
  • Organizer: 2022年度生物物理学会中部支部講演会
• [Presentation] ビブリオ菌固定子PomAPomBの単粒子解析によるイオン結合部位の解析 (2023)
  • Author(s): 〇錦野達郎、竹川宜宏、岸川淳一、廣瀬未果、小嶋誠司、本間道夫、加藤貴之、今田勝巳
  • Organizer: 2022年度べん毛交流会
• [Presentation] 細菌べん毛モーターエネルギー変換複合体の膜貫通領域とペプチドグリカン結合領域をつなぐリンカー領域の機能解析 (2023)
  • Author(s): 〇宮村優輔、錦野達郎、本間道夫、小嶋誠司
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第48回討論会
• [Presentation] 海洋性ビブリオ菌べん毛モーター固定子タンパク質PomBのリンカー領域機能解析 (2023)
  • Author(s): 〇宮村優輔、錦野達郎、本間道夫、小嶋誠司
  • Organizer: 2022年度べん毛交流会
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡単粒子解析による海洋性ビブリオ菌べん毛モーター固定子 PomAPomB のイオン透過経路の解明 (2022)
  • Author(s): 〇錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 小嶋誠司, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第48回討論会
• [Presentation] 海洋性ビブリオ菌べん毛の回転方向を制御するタンパク質 FliG の高圧 NMR による構造解析 (2022)
  • Author(s): 〇錦野達郎,小嶋誠司, 本間道夫, 宮ノ入洋平
  • Organizer: 第63回高圧討論会
• [Presentation] Atomic structure of Na+ conducting flagellar energy convertor, the PomAB complex from Vibrio alginolyticus, by Cryo-EM (2022)
  • Author(s): 〇錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 小嶋誠司, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 第95回日本生化学会大会
• [Presentation] メチオニン側鎖メチル基の信号観測による細菌べん毛モーター固定子のNa＋イオン結合による構造変化の解析 (2022)
  • Author(s): 〇錦野達郎,小嶋誠司, 本間道夫, 宮ノ入洋平
  • Organizer: 第61回NMR討論会
• [Presentation] Vibrio べん毛モーター固定子複合体の Cryo-EM による単粒子解析 (2022)
  • Author(s): 〇錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 小嶋誠司, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 第54回ビブリオシンポジウム
• [Presentation] Vibrioべん毛モーターのMSリングとCリングの構成タンパク質FliFとFliGとの融合タンパク質を大腸菌で作らせる (2022)
  • Author(s): 〇本間道夫、錦野達郎、高橋幹士、福嶋優理亜、ハオ雨希、梶野洸樹、内橋貴之、小嶋誠司
  • Organizer: 第54回ビブリオシンポジウム
• [Presentation] Cryo-EM structure analysis of the PomAB complex, a bacterial flagellar stator of sodium-driven motor in Vibrio alginolyticus (2022)
  • Author(s): 〇Tatsuro Nishikino, Norihiro Takekawa, Jun-ichi Kishikawa, Mika Hirose, Seiji Kojima, Michio Homma, Takayuki Kato, Katsumi Imada
  • Organizer: 第60回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Aquifex aeolicus の固定子A サブユニット5量体の単粒子解析 (2022)
  • Author(s): 錦野達郎
  • Organizer: べん毛研究交流会
• [Presentation] 超好熱菌 Aquifex aeolicusのべん毛固定子タンパク質 MotAの Cryo-EMによる単粒子解析 (2021)
  • Author(s): 錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 小嶋誠司, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第47回討論会
• [Presentation] Structurer of a pentameric complex of MotA, a bacterial flagellar stator protein, from Aquifex aeolicus by single particle cryo-EM (2021)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Norihiro Takekawa, Jun-ichi Kishikawa, Mika Hirose, Seiji Kojima, Michio Homma, Takayuki Kato, Katsumi Imada
  • Organizer: 第59回日本生物物理学会年会
• [Presentation] NMR analysis of the conformational transition of flagellar rotor protein FliG, that determines flagellar rotational direction in marine Vibrio (2021)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma, Yohei Miyanoiri.
  • Organizer: PDBアジア地区50周年記念シンポジウム～アジア地区構造生物学の最先端とProtein Data Bank 50年の歩み～
• [Presentation] 高度好熱菌 Aquifex aeolicus のべん毛モーター固定子 A サブユニットの単粒子解析 (2021)
  • Author(s): 錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 第74回日本細菌学会関西支部総会
• [Presentation] Cryo-EM による超好熱菌 Aquifex aeolicus 由来べん毛モーター固定子A サブユニット MotA 5 量体の構造 (2021)
  • Author(s): 錦野達郎, 竹川宜宏，岸川淳一, 廣瀬未果, 本間道夫, 加藤貴之, 今田勝巳
  • Organizer: 第67 回日本生化学会近畿支部例会
• [Presentation] . Characterization of the Conformational Exchanges of Flagellar Rotor Protein FliG, that Induces the Rotational Switching of the Bacterial Flagellar Motor (2021)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma, Yohei Miyanoiri.
  • Organizer: ISMAR-APNMR
• [Presentation] Structural differences of the flagellar rotor in the counterclockwise and clockwise rotation states (2021)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Britany Carroll, Shiwei Zhu, Seiji Kojima, Jun Liu, Michio Homma
  • Organizer: 第94回日本細菌学会総会
• [Presentation] 超好熱菌 Aquifex aeolicus のべん毛固定子タンパク質 MotA 五量体のCryo EM による構造解析 (2020)
  • Author(s): 錦野達郎, 竹川宜宏, 岸川淳一, 廣瀬未果, 今田勝巳, 加藤貴之, 本間道夫
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第46回討論会
• [Presentation] べん毛回転子タンパク質FliGの時計回り時の構造：高圧NMRによる解析 (2020)
  • Author(s): 錦野達郎, 小嶋誠司, 本間道夫, 宮ノ入洋平
  • Organizer: 日本生体エネルギー研究会第46回討論会
• [Presentation] クライオトモグラム法によるべん毛モーターの回転方向切り替えの際に生じる回転子構造変化の解析 (2020)
  • Author(s): 錦野達郎, Carroll Brittany, Zhu Shiwei, 小嶋誠司, Liu Jun, 本間道夫
  • Organizer: 第73 回日本細菌学会関西支部総会
• [Presentation] NMR analysis of the conformational change in FliG that switches the rotational direction of the flagellar motor in marine bacterium Vibrio (2020)
  • Author(s): Tatsuro Nishikino, Seiji Kojima, Michio Homma, Yohei Miyanoiri
  • Organizer: 第58回日本生物物理学会年会