高次生命現象に関わるタンパク質を解析できる単一細胞特異的プロテオーム解析法の開発

• Project/Area Number: 20J00905
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 油屋 駿介 九州大学, 生体防御医学研究所, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2023-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2020: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
• Keywords: プロテオミクス解析 / C. elegans / Caenorhabditis elegans / プロテオミクス / Cell-selective BONCAT

Outline of Research at the Start

本研究では線虫の単一神経細胞をアジド基で特異的に標識し、標識した細胞を50～100匹の線虫から回収することで、少数の線虫から目的神経細胞特異的なプロテオミクス解析を行うことを目的とする。本研究課題を行うために (1) 非天然アミノ酸による線虫一細胞特異的なタンパク質のin vivo標識 (2) 少数線虫個体から目的細胞特異的なタンパク質を調製するためのin capillary調製法の開発 の二点を行う。
最終的にはこれら二点を統合し記憶などの高次生命現象に伴って線虫の目的神経細胞で変動するタンパク質群を探索する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では線虫の単一神経細胞をアジド基で特異的に標識し、標識した細胞を50～100匹の線虫から回収することで、少数の線虫から目的神経細胞特異的なプロテオミクス解析を行うことを目的とする。
本年度は(1) 単一神経細胞に変異型フェニルアラニルtRNA転移酵素 (変異RS)を発現させるためのベクターの最適化 (2) 遺伝子回路を用いた単一神経細胞における変異RSの発現 の2点を主に行った。
(1) 単一神経細胞に変異RSを発現させるためのベクターの最適化
従来のベクターでは一部の細胞特異的なプロモーターにおいて変異RSを発現させることができなかった。そこで本年度はベクターのコザック配列を検討することで、従来と比べて発現量が多いベクターを構築した。コザック配列を検討することで、従来のコザック配列では発現することができないプロモーターにおいて、変異RSを発現することが可能となった。
(2) 遺伝子回路を用いた単一神経細胞における変異RSの発現
従来のベクターを用いると、2つのプロモーターを組み合わせなければ単一の神経細胞に変異RSを発現することができない場合に対応できない。そこでsplit cGALシステム (et al PNAS) を用いて、二つのプロモーターが共通で機能する細胞のみに変異RSを発現できるシステムを構築した。さらに、1つのプロモーターだけが機能して、もう一方のプロモーターが機能しない場合に発現するシステムをcGALシステムとCRE-Loxシステムを組み合わせで検討した。

Research Progress Status

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Produced β-hydroxybutyrate after β-hydroxy-β-methylbutyrate (HMB) administration may contribute HMB function in mice. (2021)
  • Author(s): Ikeda K#, Takahashi M#, Aburaya S, Harada D, Ikeda M, Kitagawa Y, Soma Y, Izumi Y, Bamba T, Furuse M*.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Rep. Volume: 27 Pages: 101097-101097
  • DOI: 10.1016/j.bbrep.2021.101097
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Porphyromonas gingivalis induces entero-hepatic metabolic derangements with alteration of gut microbiota in a type 2 diabetes mouse model. (2021)
  • Author(s): Kashiwagi Y#, Aburaya S#, Sugiyama N#, Narukawa Y, Sakamoto Y, Takahashi M, Uemura H, Yamashita R, Tominaga S, Hayashi S, Nozaki T, Yamada S, Izumi Y, Kashiwagi A, Bamba T, Ishihama Y, Murakami S*.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 11(1) Issue: 1 Pages: 18398-18398
  • DOI: 10.1038/s41598-021-97868-2
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Peptide barcoding for one-pot evaluation of sequence?function relationships of nanobodies (2021)
  • Author(s): Matsuzaki Yusei、Aoki Wataru、Miyazaki Takumi、Aburaya Shunsuke、Ohtani Yuta、Kajiwara Kaho、Koike Naoki、Minakuchi Hiroyoshi、Miura Natsuko、Kadonosono Tetsuya、Ueda Mitsuyoshi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 11 Issue: 1 Pages: 21516-21516
  • DOI: 10.1038/s41598-021-01019-6
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] A three-component monooxygenase from Rhodococcus wratislaviensis may expand industrial applications of bacterial enzymes (2021)
  • Author(s): Hibi Makoto、Fukuda Dai、Kenchu Chihiro、Nojiri Masutoshi、Hara Ryotaro、Takeuchi Michiki、Aburaya Shunsuke、Aoki Wataru、Mizutani Kimihiko、Yasohara Yoshihiko、Ueda Mitsuyoshi、Mikami Bunzo、Takahashi Satomi、Ogawa Jun
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 4 Issue: 1 Pages: 1-1
  • DOI: 10.1038/s42003-020-01555-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Neuronal subclass-selective proteomic analysis in Caenorhabditis elegans (2020)
  • Author(s): Aburaya Shunsuke、Yamauchi Yuji、Hashimoto Takashi、Minakuchi Hiroyoshi、Aoki Wataru、Ueda Mitsuyoshi
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 10 Issue: 1 Pages: 1-1
  • DOI: 10.1038/s41598-020-70692-w
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Selected reaction monitoring for the quantification of Escherichia coli ribosomal proteins (2020)
  • Author(s): Kosaka Yuishin、Aoki Wataru、Mori Megumi、Aburaya Shunsuke、Ohtani Yuta、Minakuchi Hiroyoshi、Ueda Mitsuyoshi
  • Journal Title: PLOS ONE Volume: 15 Issue: 12 Pages: e0236850-e0236850
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0236850
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 線虫Caenorhabditis elegansの神経細胞種特異的なプロテオミクス解析 (2021)
  • Author(s): 油屋 駿介, 山内 悠至, 馬場 健史, 植田 充美, 青木 航
  • Organizer: 第73回 日本生物工学会大会