| Project/Area Number |
20J10085
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 49020:Human pathology-related
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University (2021)
Osaka University (2020) |
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Principal Investigator |
張 春明 京都産業大学, 生命科学部, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2022-03-31
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| Project Status |
Discontinued (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2020: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 膜蛋白質複合体 / 発現・精製 / Cryo-EM / 単粒子構造解析 / 破傷風毒素 / グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素 / 結晶構造解析 / 溶液構造解析 / 低温電子顕微鏡法解析 |
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| Outline of Research at the Start |
これまでのポリマーによる線維形成の促進および阻害効果の研究は、溶解度と熱力学の解析にとどまっていた。そこで本研究では、Cryo-EMを用いて、そこに内在する普遍的な物理学的現象を明らかにすると共に、ポリリン酸に注目して長期血液透析患者におけるβ2ミクログロブリン線維形成機構を理解するという取り組みは本研究が初めてである。また、本研究によって得られた生体環境におけるβ2ミクログロブリン線維形成の機構から、線維形成を予測・制御し、意図的に線維形成を促進または阻害できるようになることは、薬学的にも病理学的にも、さらには産業方面にも幅広い展望と将来性を持った研究と言うことができる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、私はミトコンドリアと小胞体の膜接触サイト(ERMES)複合体のCryo-EM構造解析を研究活動の中心に据え、チャレンジしてきた。先ず、構築できた高発現株を用いて、ERMES複合体の大量培養・高純度でのアフィニティ精製に成功した。収量は約7 mg/ml、100 μlだった。次に、精製できた複合体を用いて、Cryo-EM グリッドを作成し、Talos Arctica（東大・吉川研）で界面活性剤 (Digitonin と GDN)、サンプル濃度 (5～20 mg/mL)とグリッド (Au and Cu/Rh)の検討を行った。グリッドをスクリーニングした結果、低濃度より高濃度、Cu/RhよりAu、DigitoninよりGDNの方が単分散性と角分布のよい粒子（ミセル-蛋白質複合体）が観察された。そして、Krios G3i_Serial EM を用いて、ERMES複合体の電顕画像を収集し、所属研究室に導入・整備されているCryo-EM workstation を用いて、Relionなどの解析ツールで、単粒子構造解析を行った。また、ERMESの構成サブユニットであるMmm1の膜貫通（TM）領域で小胞体膜に結合，Mmm2-Mdm10によりミトコンドリア膜に結合しているので、Mmm1のTM領域をプロテアーゼで切り除くことによって、ERMES複合体の可溶性が高まり凝集が抑えられる、ナノディスクなどへの再構成が容易になることが期待できるため、(TMΔ-Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]或いは(GFP_TM-3C_Mmm1-3xFlag, Mmm2-10xHis, Mdm10(Y73A/Y75A)-twin_strep, Mdm12, Vps39Δ)]株の構築・発現を検討している。
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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