難治性固形癌への効率的抗体デリバリーを可能とする二段階送達システムの開発

• Project/Area Number: 20J11536
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 50020:Tumor diagnostics and therapeutics-related
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 山内 聡一郎 熊本大学, 薬学教育部, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000); Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000); Fiscal Year 2020: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
• Keywords: 環状一本鎖抗体 / インテイン反応 / Diabody / avidity効果 / PEG化 / 抗HER2抗体 / 次世代抗体モダリティ / 分子動力学計算

Outline of Research at the Start

本研究では、環状scFvと近赤外光応答性ナノ粒子の融合により、EPR効果の付与および癌間質でのscFv放出を可能とする環状scFvの二段階送達システムの構築を目指す。独自に開発した環状scFv可溶性発現システムを活用することで効率良く環状scFvを大量調製し、その生物活性および体内動態等を細胞・動物実験により評価する。その後、環状scFvを封入した近赤外光応答性リポソームを作製し、動物実験により生物活性および体内動態等について評価を行い、本システムの有効性を確認する。

Outline of Annual Research Achievements

以下に本年度の研究において得られた知見をまとめる。
（1）インテイン反応を利用した大腸菌体内環状scFv調製法を用いてTrastuzumab由来の環状scFv（Tras-scFv）を調製した。本手法で調製した環状scFvは連結部分に新たなシステイン残基が導入される。このシステイン残基を利用してscFvの欠点である抗原結合価数の減少による抗原結合力の低下を補うために、チオール反応性の官能基を持つ架橋剤を用いて環状Tras-scFv二量体を調製した。表面プラズモン共鳴（SPR）測定の結果、環状Tras-scFv単量体と比較して、環状Tras-scFv二量体はavidity効果により抗原結合力が向上していることを確認した。
（2）環状scFvの保存安定性および血中滞留性の向上を目指し、環状Tras-scFv中のシステイン残基に対して様々な分子量の直鎖型および分岐型PEG鎖を部位特異的に修飾したPEG化環状scFvを調製した。Trastuzumab-HER2複合体立体構造から、PEG修飾部位はscFvの抗原認識部位とは反対側に位置することを確認したため、PEG修飾は環状scFvの抗原結合活性に影響を与えないと予想した。実際にSPR測定による解析を行った結果、PEG修飾による抗原結合活性の大幅な低下は確認されなかった。続いて、保存安定性に関して検討した結果、PEG修飾により耐熱性および凍結乾燥後の溶解性が有意に向上することが明らかとなった。また、健常マウスを用いた体内動態解析を行った結果、PEG修飾による分子量増大に伴い、環状Tras-scFvの消失半減期が最大で15倍延長した。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Expression, Purification and Characterization of CAR/NCOA-1 Tethered Protein in <i>E. coli</i> Using Maltose-Binding Protein Fusion Tag and Gelatinized Corn Starch (2021)
  • Author(s): Kobashigawa Yoshihiro、Namikawa Mana、Sekiguchi Mitsuhiro、Inada Yuki、Yamauchi Soichiro、Kimoto Yuu、Okazaki Kyo、Toyota Yuya、Sato Takashi、Morioka Hiroshi
  • Journal Title: Biological and Pharmaceutical Bulletin Volume: 44 Issue: 1 Pages: 125-130
  • DOI: 10.1248/bpb.b20-00759
  • NAID: 130007965289
  • ISSN: 0918-6158, 1347-5215
  • Year and Date: 2021-01-01
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Molecular recognition of a single-chain Fv antibody specific for GA-pyridine, an advanced glycation end-product (AGE), elucidated using biophysical techniques and synthetic antigen analogues. (2021)
  • Author(s): Kobashigawa, Y., Ohara, T., Morita, K., Toyota, Y., Nakamura, T., Kotani. S., Arimori, T., Yamauchi, S., Liu, C., Kitazaki, M., Wakeyama-Miyazaki, Y., Suwa, Y., Uchida-Kamekura, M., Fukuda, N., Sato, T., Nakajima, M., Takagi, J., Yamagata, Y., and Morioka, H
  • Journal Title: J. Biochem Volume: 170 Issue: 3 Pages: 379-387
  • DOI: 10.1093/jb/mvab056
  • NAID: 40022721879
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Convenient method of producing cyclic single-chain Fv antibodies by split-intein-mediated protein ligation and chaperone co-expression (2020)
  • Author(s): Liu Chenjiang、Kobashigawa Yoshihiro、Yamauchi Soichiro、Fukuda Natsuki、Sato Takashi、Masuda Takeshi、Ohtsuki Sumio、Morioka Hiroshi
  • Journal Title: The Journal of Biochemistry Volume: 168 Issue: 3 Pages: 257-263
  • DOI: 10.1093/jb/mvaa042
  • NAID: 40022375418
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 一本鎖抗体の製剤特性改善に向けたPEG修飾の有用性評価 (2021)
  • Author(s): 山内聡一郎、佐藤卓史、小橋川敬博、水田夕稀、前田仁志、渡邉博志、丸山徹、森岡弘志
  • Organizer: 第94回 日本生化学会大会
• [Presentation] Cyclic scFv : A low molecular weight antibody with reduced aggregation propensity for biomedical use (2020)
  • Author(s): Soichiro Yamauchi, Chenjiang Liu, Natsuki Fukuda, Takashi Sato, Yoshihiro Kobashigawa, Hiroshi Morioka
  • Organizer: 第20回 日本蛋白質科学会年会
• [Book] 創薬研究のための相互作用解析パーフェクト (第1章 II-12「ファージディスプレイ法を用いた一本鎖抗体の改変」) (2021)
  • Author(s): 山内 聡一郎、小橋川 敬博、佐藤 卓史、森岡弘志
  • Total Pages: 11
  • Publisher: 羊土社
  • ISBN: 9784758122566
• [Remarks] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野ホームページ
  • URL: http://seimeibunseki.org
• [Remarks] 熊本大学 大学院生命科学研究部 生命分析化学分野ホームページ
  • URL: http://seimeibunseki.org
• [Patent(Industrial Property Rights)] PEG化環状一本鎖抗体 (2020)
  • Inventor(s): 森岡 弘志、小橋川 敬博、佐藤 卓史、山内 聡一郎
  • Industrial Property Rights Holder: 熊本大学
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2020