DNA複製複合体の構造変換による、RNAプライマー鎖長の制御機構の解明

• Project/Area Number: 20J12260
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 沖 啓輔 九州大学, 生物資源環境科学府, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000); Fiscal Year 2021: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000); Fiscal Year 2020: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
• Keywords: アーキア / DNA複製 / DNAポリメラーゼ / プライマーゼ / ヘリカーゼ / 超分子複合体

Outline of Research at the Start

本研究の目的は、極限環境に生息するアーキアのゲノムDNA複製過程の詳細な分子機構を解明することである。特に、RNAプライマーの合成からDNA鎖伸長への効率的な移行を可能にする分子機構に注目し、超好熱性アーキアThermococcus kodakarensisのレプリソームにおいて、複製ポリメラーゼ (PolD) とその補助因子 (PCNA) 及びプライマーゼ (PriS/PriL) の複合体形成の制御機構解明を、立体構造解析とin vitro、in vivoにおける生化学的解析の両面から進める。

Outline of Annual Research Achievements

アーキアの複製ポリメラーゼであるPolDが、CMGヘリカーゼ (MCM-GINS-GAN複合体) とプライマーゼのブリッジとなることでレプリソームを形成することを昨年度報告した。そこで、CMGヘリカーゼとPolDの複合体形成に関してさらに詳細な解析を行ったところ、GINSが2分子のPolDと強固に結合することが証明された。次にこの相互作用は、PolDのDP1サブユニットのN末端ドメイン(DP1N)とGINSのGins51サブユニットのC末端ドメイン(Gins51C)との結合によることを示し、DP1N-Gins51C-GAN三者複合体の結晶構造解析を行なった。さらに、DP1N-Gins51Cを介した結合が存在する条件でのみ、PolDがCMG様ヘリカーゼの一本鎖DNA依存性のヘリカーゼ活性を促進することを発見した。すなわち、リーディング鎖上を進行するCMGヘリカーゼにPolDが結合することによって、親DNA二本鎖を解く反応が促進されるという、ヘリカーゼ-ポリメラーゼ間の機能的な相互作用を初めて実験的に証明した。これらの結果をまとめて論文発表を行なった。
CMGヘリカーゼとPolDの強固な結合とは対照的に、PolDとプライマーゼの複合体形成はPolD-PCNA-DNA複合体の形成とともに解消される。PolDとプライマーゼの相互作用部位についても詳細な構造解析が必要と考えた。PolDのDP2サブユニットのcPIPを模した合成ペプチドを設計し、精製したPriLのN末端ドメイン (PriLN)と混合して結晶構造解析を行なったところ、PriLNに存在する疎水性ポケットに、ヘリックス構造を形成したDP2cPIPが結合することが明らかとなり、部位特異的変異体を用いた生化学的解析によって複合体の形成における重要性が証明された。これらの結果をまとめて学会発表を行なった。論文投稿準備を進めている。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Family D DNA polymerase interacts with GINS to promote CMG-helicase in the archaeal replisome. (2022)
  • Author(s): Oki, K., Nagata, M., Yamagami, T., Numata, T., Ishino, S., Oyama, O., and Ishino, Y.
  • Journal Title: Nucleic Acids Res. Volume: 50 Issue: 7 Pages: 3601-3615
  • DOI: 10.1093/nar/gkab799
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] DNA polymerase D temporarily connects primase to the CMG-like helicase before interacting with proliferating cell nuclear antigen (2021)
  • Author(s): Oki Keisuke、Yamagami Takeshi、Nagata Mariko、Mayanagi Kouta、Shirai Tsuyoshi、Adachi Naruhiko、Numata Tomoyuki、Ishino Sonoko、Ishino Yoshizumi
  • Journal Title: Nucleic Acids Research Volume: 49 Issue: 8 Pages: 4599-4612
  • DOI: 10.1093/nar/gkab243
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Two conformations of DNA polymerase D-PCNA-DNA, an archaeal replisome complex, revealed by cryo-electron microscopy (2020)
  • Author(s): Mayanagi Kouta、Oki Keisuke、Miyazaki Naoyuki、Ishino Sonoko、Yamagami Takeshi、Morikawa Kosuke、Iwasaki Kenji、Kohda Daisuke、Shirai Tsuyoshi、Ishino Yoshizumi
  • Journal Title: BMC Biology Volume: 18 Issue: 1 Pages: 152-152
  • DOI: 10.1186/s12915-020-00889-y
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 超好熱性アーキア Thermococcus kodakarensisのレプリソームにおけるPolD上でのプライマーゼからPCNAへの置換による機能変換 (2021)
  • Author(s): 沖啓輔、山上健、永田麻梨子、真柳浩太、白井剛、安達成彦、沼田倫征、松本俊介、石野園子、石野良純
  • Organizer: 第94回日本生化学会大会
• [Presentation] Thermococcus kodakarensisのDNA複製複合体レプリソームの機能的構造変換機構 (2021)
  • Author(s): 沖啓輔、永田麻梨子、山上健、真柳浩太、白井剛、大山拓次、安達成彦、沼田倫征、松本俊介、石野園子、石野良純
  • Organizer: 極限環境生物学会2021年度(第22回)年会
• [Presentation] Structural and functional analysis of the interaction between family D-DNA polymerase and CMG-like helicase in the replisome of Thermococcus kodakarensis. (2021)
  • Author(s): 沖啓輔、永田麻梨子、山上 健、沼田倫征、石野園子、大山拓次、石野良純
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Two conformations of DNA polymerase D-PCNA-DNA complex in a hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis (2020)
  • Author(s): 沖 啓輔、真柳浩太、宮崎直幸、石野園子、山上 健、森川耿右、岩崎憲治、神田大輔、白井 剛、石野良純
  • Organizer: 2020年度日本フードファクター学会・日本農芸化学西日本支部会合同大会