| Project/Area Number |
20J13292
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43060:System genome science-related
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
國井 厚志 広島大学, 統合生命科学研究科, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2022-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2021)
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| Budget Amount *help |
¥2,100,000 (Direct Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000)
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| Keywords | 転写調節 / エピゲノム編集 / CRISPR-Cas9 / 因子集積 / 選択的スプライシング |
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| Outline of Research at the Start |
ヒトを含む真核生物の細胞内では、選択的スプライシング機構の存在により、単一の遺伝子座から複数種類のタンパク質が生じることが知られている。近年、その制御の一端にDNAメチル化やヒストン修飾などのエピゲノムが関与し、破綻すると疾患の原因になり得ることが明らかにされ始めた。一方、どの遺伝子座での制御破綻が疾患に繋がるかは不明な部分が多い。そこで本研究では、エピゲノムの状態を領域特異的に改変する技術「エピゲノム編集」を駆使し、選択的スプライシング異常と疾患との関係性を明らかにするための基礎技術の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度、４種類のＲＮＡ-タンパク質結合システムおよび3種類のタンパク質タグシステムを取り入れ、因子の集積効果を体系的に比較可能なシステム群「ＥＡＲＴＨコレクション」を整備し、転写活性化因子の使用において、一部のシステムがmRNAレベルで従来型を上回ることを見出していた。今年度は、標的遺伝子（ＲＡＮＫＬ、ＣＴＣＦＬ、ＭＭＰ９）のタンパク質レベルでの発現解析（ウェスタンブロット解析および免疫染色）を実施した。細胞株は、前年度に引き続きＨＥＫ２９３Ｔ株とＭＣＦ－７株を使用した。
ＲＡＮＫＬ遺伝子およびＣＴＣＦＬ遺伝子の活性化では、ウェスタンブロット解析においてはいずれも目的とするシグナルが検出されなかったものの、免疫染色においては、ＭＣＦ－７株でのＲＡＮＫＬ遺伝子、ＨＥＫ２９３Ｔ株でのＣＴＣＦＬ遺伝子におけるシグナルの増強が確認された。
ＭＭＰ９遺伝子の活性化では、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ－７の両株でのウェスタンブロット解析において、システム導入によりシグナルが出現し、システム間での強弱は、ｍＲＮＡレベルでの結果と関連性がみられた。なおＭＭＰ９は、細胞外に分泌後、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）を分解する機能を有することから、培養上清からのＭＭＰ９の検出も検討したところ、システム導入によって強いシグナルが出現した。免疫染色でも、特にＭＣＦ－７株ではシステム導入により明瞭なシグナルが出現した。これらの結果から、ＥＡＲＴＨコレクションによって、ｍＲＮＡだけでなくタンパク質レベルでの発現も誘導されたことが確認された
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| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
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