ATP7ファミリーの機能・構造解析

• Project/Area Number: 20J13299
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 富田 篤弘 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC2)
• Project Period (FY): 2020-04-24 – 2022-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥1,900,000 (Direct Cost: ¥1,900,000); Fiscal Year 2021: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000); Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
• Keywords: ATPase / タンパク質精製 / タンパク質発現 / 構造解析 / 生物物理 / 構造生物学 / P型ATPase

Outline of Research at the Start

本研究では(1)ATP7 ファミリーと ATOX1 との複合体の構造を決定することで ATP7 ファミリーに対する ATOX1 からの銅イオンの受け渡し機構を明らかにし、(2) ATP7 ファミリーの構造を銅イオン存在下で輸送過程の複数の状態で決定し、得られた構造をもとに脂質と水分子を含む生体内の条件を再現した全原子分子動力学シミュレーション(MD シミュレーション)を行うことで銅イオンの輸送経路・輸送機構を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究ではATP7 ファミリーと ATOX1 との複合体の構造を決定することで ATP7 ファミリーに対する ATOX1 からの銅イオンの受け渡し機構を明らかにし、ATP7 ファミリーの構造を銅イオン存在下で輸送過程の複数の状態で決定し、得られた構造をもとに 脂質と水分子を含む生体内の条件を再現した全原子分子動力学シミュレーション (MD シミュレーション を行うことで銅イオンの輸送経路・輸送機構を明らかにすることを目標とする。
ATP7 ファミリーの構造決定に先駆けて、発現方法・精製方法の検討およびグリッド作成方法の検討を行った。その結果、ヒト由来の ATP7A/7B について構造決定に十分な純度・収量での精製方法の確立に成功し、クライオ電子顕微鏡での構造決定に向けたグリッドの調整方法の確立に成功した。しかしながら、調整したグリッドからは構造決定に十分な二次元投影像および二次元平均像を得ることはできなかった。原因としては、試料の均一性が 不十分であった点・精製試料の一部が凝集して二次元構造を維持していなかった点が挙げられる。これらの問題を解決するために、今後はタンパク試料の発現・精製方法の改善及びグリッド作成方法の最適化を行った。具体的には、凝集体を形成しているタンパク質の量を減らすために発現・精製方法の改善を行う。具体的には発現ホストを現在のHEK293SからGNT1を欠失 していないHEK293Fなどに変更することでより生体内に近い糖鎖修飾が施されたタンパク質の発現を行い、基質存在下で精製を行うことで試料の安定化を試みた。しかしながら、試料の付近に次正を解決するに至らず、構造決定に十分な二次元像を得ることはできなかった。本研究で得られたATP7ファミリーの発現・精製方法は今後ATP7ファミリーの機能・構造解析を進めていく大きな糧となる重要な成果である。

Research Progress Status

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和3年度が最終年度であるため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Structure of the type V-C CRISPR-Cas effector enzyme (2022)
  • Author(s): Kurihara Nina、Nakagawa Ryoya、Hirano Hisato、Okazaki Sae、Tomita Atsuhiro、Kobayashi Kan、Kusakizako Tsukasa、Nishizawa Tomohiro、Yamashita Keitaro、Scott David A.、Nishimasu Hiroshi、Nureki Osamu
  • Journal Title: Molecular Cell Volume: 82 Issue: 10 Pages: 1865-1877
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2022.03.006
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cryo-EM reveals mechanistic insights into lipid-facilitated polyamine export by human ATP13A2. (2021)
  • Author(s): Tomita, A., Daiho, T., Kusakizako, T., Yamashita, K., Ogasawara, S., Murata, T., Nishizawa, T. and Nureki, O.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 81 Issue: 23 Pages: 4799-4809
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.11.001
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Cryo-EM structure of the β3-adrenergic receptor reveals the molecular basis of subtype selectivity. (2021)
  • Author(s): Nagiri, C., Kobayashi, K., Tomita, A., Kato, M., Kobayashi, K., Yamashita, K., Nishizawa, T., Inoue, A., Shihoya, W. and Nureki, O.
  • Journal Title: Mol. Cell Volume: 81 Issue: 15 Pages: 3205-3215
  • DOI: 10.1016/j.molcel.2021.06.024
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Cryo-EM structures of ATP13A2 reveal transport mechanism of polyamines (2021)
  • Author(s): 富田 篤弘
  • Organizer: 第21回日本蛋白質科学会年会
  • Invited
• [Presentation] クライオ電子顕微鏡単粒子解析と分子動力学シミュレーションを用いたATP13A2のポリアミン輸送機構の解明 (2021)
  • Author(s): 富田 篤弘
  • Organizer: ２０２１年第５９回生物物理学会年会
  • Invited