| Project/Area Number |
20J20880
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 37020:Chemistry and chemical methodology of biomolecules-related
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
瀧野 純矢 北海道大学, 理学院・理学研究院, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2020-04-24 – 2023-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥2,800,000 (Direct Cost: ¥2,800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2021: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,000,000 (Direct Cost: ¥1,000,000)
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| Keywords | 天然物化学 / 有機化学 / 生合成 / ポリケタイド / 麹菌異種発現 / ゲノム編集 |
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| Outline of Research at the Start |
最近我々はゲノム編集を用いて天然物生合成遺伝子を麹菌ゲノム上の狙った位置に導入する手法を確立しつつある。そこで本研究では、構造多様性に富み臨床上重要な化合物も多数知られるポリケタイド系天然物などを合成するモジュール式の巨大酵素についても本手法を利用し、生合成遺伝子クラスターの異種発現を行う。また、構築した異種発現株を基盤とした、モジュールを構成する機能単位 (ドメイン)やクラスター中の遺伝子をアミノ酸配列が似た別のドメインや遺伝子との交換などにより、ドメイン間の相互作用やアミノ酸配列と生成物との関連等の巨大酵素が有する複雑な生合成機構への知見を得る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、ゲノム編集を基軸とした巨大酵素の機能解析とエンジニアリングを目的として研究を進めている。昨年度までに、ゲノム編集による麹菌ホットスポットへの遺伝子導入によって、繰り返し型ポリケタイド合成酵素 (HR-PKS)の網羅的解析を行い、立体制御の一般的な規則を提唱した。本年度は、HR-PKSによる骨格形成以降の反応に焦点をあて、酸無水物二量体ホモイドライドB生合成を研究対象として、構造多様性創出に寄与する酵素遺伝子の探索を行った。
ホモイドライドBはコレステロール値低下作用を示す糸状菌由来天然物であり、無水マレイン型モノマーが二量化した構造を有する。糸状菌は同様のモノマーによって合成される酸無水物二量体を多数生産するが、ホモイドライドBは他の類縁体には見られない特徴的なカゴ型構造を有している。本年度は、カゴ型構造形成機構を明らかにし、ポリケタイド系天然物の構造多様性創出の鍵となる酵素の探索を行った。以前に構築していた骨格構造生産麹菌に対して、生合成遺伝子クラスター中の機能未解析遺伝子4種の追加導入を行った結果、最終産物ホモイドライドBを観測することに成功した。次いで、ゲノム編集による迅速な機能解析によって、導入遺伝子の組み合わせを変えた形質転換体を作製することで、メチル基転移酵素がカゴ型構造形成の鍵酵素であることを明らかにした。本酵素の反応機構を詳細に解析する為、大腸菌により組換えタンパク質を調製し、補酵素の有無、阻害剤の添加、メチル化副生成物の構造決定によって、SAM依存的メチル化を起点としたアセタール形成によって、カゴ型構造が構築されることを明らかにした。この機構は初の解析例であることに加え、TstEホモログが類縁PKSクラスターでも観測されたことから、同様のカゴ型構造を有する天然物探索にも展開できると考えられる。
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| Research Progress Status |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和4年度が最終年度であるため、記入しない。
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