| Project/Area Number |
20K05818
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | Fukuoka University |
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Principal Investigator |
鹿志毛 信広 福岡大学, 薬学部, 教授 (80185751)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 朝光 福岡大学, 薬学部, 教授 (90369025)
山本 雅達 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 助教 (40404537)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | ゲノム組み込み型ベクター / 乳酸菌 / EPA / ゲノム組込型ベクター / 遺伝子改変 / 機能性乳酸菌 / ゲノム改変 / エイコサペンタエン酸 |
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| Outline of Research at the Start |
乳酸菌をドラッグデリバリーシステムに応用する研究は急速に発展しつつあるが、その多くは薬剤耐性遺伝子を保持するプラスミドを用いた遺伝子組換え技術が用いられており、選択圧のないヒト消化管内ではプラスミドを脱落した菌が優性に出現すると考えられる。
本研究では、安定かつ安全な乳酸菌の遺伝子改変技術を確立することを目的として、ゲノム組込み型宿主―ベクターの開発と組換えによってゲノムに挿入された薬剤耐性遺伝子を除去出来るシステムの構築を行ない、このシステムを用いてエイコサペンタエン酸（EPA）を産生する組換え乳酸菌を作出し、高脂血症モデルマウスに経口投与による治療実験を行ってその有効性を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
選択圧の無い環境下においても遺伝的形質を安定に保持し、薬剤耐性遺伝子に依存しない乳酸菌の遺伝子改変技術を確立することを目的として、ゲノム組み込み型ベクターの開発とゲノムに配座した薬剤耐性遺伝子を除去することが出来る in vivo excision システムの構築を行なう。L. casei ATCC27092に溶原化する PL-2 ファージ integrase 遺伝子とアタッチメントサイト(attP)からなる部位特異的組換え領域を用いて大腸菌ではプラスミド型、乳酸菌ではゲノム組み込み型として機能するシャトルベクターpAE0を構築し、その宿主として PL-2 ファージ溶原株である L.casei から PL-2 ファージを脱落させたキュアリング株 (C5株)を単離している。pAE0 にEPA 合成遺伝子を挿入してC5株を形質転換したところ、得られたC5EPA株は選択圧のない条件下 70 世代の培養後においても EPA 合成遺伝子を保持しており、HPLCによりEPAの産生が確認されている(未発表データ)。本年度はゲノム組み込み型で乳酸菌ゲノムに外来遺伝子と同時に配座するベクター由来の大腸菌の複製ユニット(Ori)とエリスロマイシン耐性遺伝子(EmR)を含めた不要領域(Ori-EmR)を除くin vivo excisionシステムを構築するために以下の実験を行った。
1）D-リボース誘導性に溶菌酵素を発現するゲノム組み込み型のカウンターマーカーベクターpAEFRTGlysの作動条件の適正化と活性測定
2）LDHプロモーター作動性に組み換え酵素FLPを発現するin vivo excision ヘルパープラスミドpHILCLFの作製と作動条件の適正化
3）pAEFRTGlysをゲノムに保持する乳酸菌No.18株と41株にpHILCLFを導入した株のカウンターマーカー部分の切り出しの確認
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
乳酸菌ゲノムに外来遺伝子を導入するベクターに含まれるOri-EmRをin vivo excision システムによって除かれたクローンを選択するために予めOri-EmRが切り出されなかったクローンを誘導的に死滅させるカウンターマーカーが必要となる。ゲノム上に配座するOri-EmRを組み換え反応によって削除するために組み換え酵素FLPを発現するヘルパープラスミドを構築する必要がある。本年度は宿主のゲノムに配座した薬剤耐性遺伝子を除去することが出来るin vivo excisionシステムの構築のために以下の実験を行ったが、システムの最適化には至っていない。
1)リボース誘導性に溶菌酵素を発現するゲノム組み込み型カウンターマーカーベクターpAEFRTGlysの作動条件の適正化：pAEFRTGlysを保持する株(No.18株と41株)の増殖アッセイとその培養上清と菌体内祖抽出物による溶菌試験では、リボース含有培地で培養した場合にわずかな溶菌活性と寒天培地における増殖抑制を確認した。
2)LDHプロモーター作動性に組換え酵素FLPを発現するin vivo excisionヘルパープラスミドpHILCLFの作動条件の適正化：LDHプロモーターの下流にFLP遺伝子を連結したpHILCLFを構築した。pHILcFLP導入された株よりもpHILCLFを導入した株の方がより高いレベルでFLPを発現していることを確認した。
3)pAEFRTGlysをゲノムに保持する乳酸菌No.18株と41株にpHILCLFを導入した株のカウンターマーカー部分の切り出しの確認：No.18株と41株のゲノムDNA上のFRTに挟まれるHolynおよびLysin遺伝子の除去の有無を確認したが、除去されていない菌と除去された菌が混在しており、FRT部位における組み換えが効率よく行われていない結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
【現在までの進捗状況】の３）において、pHILCLFを導入した株からFLPが発現し、その基質であるゲノム上のFRT配列によって組み換えが起こり、その領域に挟まれるOri-EmRが除去された株を単離することができた。しかしながらそれらの多くの株は組み換えを起こしていない菌と組み換えを起こした菌が混ざっている状態であったため、組換えを起こした菌のみを濃縮できるようにより高い溶菌活性を示す条件検討を行う必要がある。一方、乳酸菌の溶原株であるPL-2ファージのHolynおよびLysin溶菌酵素遺伝子を用いてカウンターマーカを作製し、同じくネガティブセレクションに利用できるかどうかを検討する。また、疫病カビ（Saprolegnia diclina）のEPAの産生はC18:1のアラキドン酸からC20:5のEPAと変換されること、その過程でデルタ17-Desaturaseの活性が律速段階であることが報告されている。我々が作製したC5EPA株によるEPAの産生は野生型L.CaseiのC18:1に対してピークが減少していることから、C5EPA株においてもEPAの産生にC18:1が利用されている可能性がある。引き続きL.Caseiへの17-Desaturaseの cDNAの発現ベクターを構築し、EPA産生の効率化が上昇するかどうかを検討する。
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