Gene edition in endangered endemic fish for the ptoduction of immunodeficient recipient to generate oocytes through trnasplantation

• Project/Area Number: 20K06100
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 39060:Conservation of biological resources-related
• Research Institution: Ritsumeikan University
• Principal Investigator: 高田 達之 立命館大学, 薬学部, 教授 (90206756)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西江 友美 立命館大学, 薬学部, 助教 (30784524)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2021: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000); Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
• Keywords: rag2 / ゲノム編集 / ホンモロコ / 卵子形成 / 琵琶湖固有種 / 卵子作製 / 絶滅危惧種 / 固有魚種

Outline of Research at the Start

多くの野生淡水魚の絶滅が急激に進んでおり、生態系バランス維持の観点から、それらの集団としての保全が重要である。体外受精を行う魚類では保全手段として配偶子の凍結保存が適していると考えられる。魚類精子の凍結保存法は確立されているが、卵子は多くの脂質等を含むため凍結保存が困難であり、実用的な方法が開発されていない。そこで本研究では、まず、絶滅危惧種である琵琶湖固有種ホンモロコ(Gnathopogon caerulescens)において免疫不全個体をゲノム編集により作製する。次に、凍結保存した生殖幹細胞・卵原細胞を免疫不全個体の皮下または卵巣へ移植して受精可能な卵子を形成させることを試みる。

Outline of Annual Research Achievements

絶滅危惧種の保全を目的とし、琵琶湖固有種ホンモロコ(Gnathopogon caerulescens)を用いて精原細胞の凍結保存、及び精子の完全in vitro培養を確立してきた。一方で卵子のin vitro培養に関しては、ある程度の成長は認められるが受精可能な卵子生産は困難であったことから生殖幹細胞の移植による卵子作製を目的とし、ゲノム編集による免疫寛容個体の作製を試みた。
これまでにrag2ヘテロ変異体として(+7/wt)、(+8/wt)、(+2/wt)の3系統を確立することができた。これらは野生型wtとほぼ変わらない飼育が可能であった。ホモ変異体の作製のため、春に人工催熟を試みた。雄は例年通り性成熟が認められ、精子を生産したが雌では性成熟する個体数は少なく、成熟した個体も産卵しなかった。そこでホルモン注射による人工授精を試みたが得られた卵子は全て過熟卵であった。雌においては現在の実験室飼育環境下、及び人工催熟方法では性成熟に1年以上を有すると考えられた。昨年度、通常繁殖期とは異なる秋に人工催熟により両アリルにそれぞれ異なる変異を有するrag2変異体(+7/-4)を作製することができた。これらの育成を行い、wtと同様に飼育可能であったことから今回作製したrag2変異体は野生型WTと同様な飼育環境下での飼育維持が可能であることが明らかとなった。現在rag2ヘテロ変異体(+7/wt)、(+8/wt)、(+2/wt)およびrag2変異体(+7/-4)においてもwt同様の人工催熟を行い、メスと思われる個体においても腹部の膨大から性成熟の進行を確認している。rag2変異体(+7/-4)の性成熟が認められることからrag2ホモ変異体が卵子作成のための移植実験に使用可能であると考えられる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ほぼ順調にrag2ヘテロ(+7/wt)、(+8/wt)、(+2/wt)、および異なる変異(+7/-4)を有する変異体の育成が進行している。実験室における飼育環境下での人工催熟条件も確立し、ホンモロコが小型実験魚として研究室で利用可能であることを示した。一方でオスの人工催熟は比較的容易であるがメスの人工催熟が困難であり、現在の飼育環境下では性成熟に1年以上を有することがわかった。
両アリルに異なる変異(+7/-4)を有する変異体がwtと同様に飼育、育成、人工催熟が可能であることから今回作製したrag2変異体はホモでの維持、世代交代も可能と考えられ、本研究の目的である卵子作製の宿主として移植実験に使用可能であることが示された。

Strategy for Future Research Activity

人工催熟を継続し、rag2ヘテロ(+7/wt)、(+8/wt)、(+2/wt)および異なる変異(+7/-4)を有する変異体同士の交配、または人工授精によりホモ個体の作製を行う。実験室における飼育環境下においてメスの人工催熟が困難であり、1年以上を有することがわかってきた。メスの性成熟、卵子生産には低密度での飼育が重要であると考えられる。ホモ個体の作製、育成を行い、移植実験が可能な個体数を確保すると共に、卵子生産のための移植実験を遂行のため、移植実験手技、技術を確立する。またrag2変異体において実際にリンパ球におけるV(D)J遺伝子再構成の低下、リンパ球数の低下が起こっていることをPCR、フローサイトメトリーにより確認することを試みる。

Research Products

• [Journal Article] Identification of TEKTIN1-expressing multiciliated cells during spontaneous differentiation of non-human primate embryonic stem cells (2023)
  • Author(s): Nishie T., Ohta Y., Shirai E., Higaki S., Shimozawa N., Narita K., Kawaguchi K., Tanaka H., Mori C., Tanaka T., Hirabayashi M., Suemori H., Kurisaki A., Tooyama I., Asano S., Takeda S., Takada T.
  • Journal Title: Genes to Cells Volume: - Issue: 7 Pages: 516-525
  • DOI: 10.1111/gtc.13031
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Nonyophenol reduced the number of haploids in in vitro spermatogenesis of the endangered cyprinid Gnathopogon caerulescens (2023)
  • Author(s): Nishie T., Komaru. A., Shiroguchi S., Yamaizumi T., Ono Y., Motomochi A., Tooyama I., Fujioka Y., Sakai N., Higaki S., Takada T.
  • Journal Title: Toxicology in Vitro Volume: 89 Pages: 105565-105565
  • DOI: 10.1016/j.tiv.2023.105565
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Alteration in peritoneal cells with the chemokine CX3CL1 reverses age-associated impairment of recognition memory (2022)
  • Author(s): Takei,Y., Amagase,Y., Iida,K.,Sagawa,T., Goto,A.,Kambayashi,R., Izumi-N,H., Matsumoto,A., Kawai,S., Sugiyama,A., Takada T., Hirasawa A.
  • Journal Title: GeroScience Volume: 44 Issue: 4 Pages: 2305-2318
  • DOI: 10.1007/s11357-022-00579-3
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Global DNA Methylation in Cord Blood as a Biomarker for Prenatal Lead and Antimony Exposures (2022)
  • Author(s): Okamoto, Y., Iwai-Shimada, M., Nakai K., Tatsuma, N., Mori, Y, Aoki, A, Kojima, N., Takada, T., Satoh, H., and Jinno, H.,
  • Journal Title: Toxics Volume: 10 Issue: 4 Pages: 157-157
  • DOI: 10.3390/toxics10040157
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Germ cell-specific expression of Venus by Tol2-mediated transgenesis in endangered endemic cyprinid Honmoroko (Gnathopogon caerulescens) (2021)
  • Author(s): Higaki S.*, Nishie T.*, Todo T., Teshima R., Kusumi K., Mitsumori R., Tooyama I., Fujioka Y., Kawasaki T., Sakai N., Takada T.
  • Journal Title: J. Fish Biol Volume: 99 Issue: 4 Pages: 1341-1347
  • DOI: 10.1111/jfb.14840
  • Peer Reviewed
• [Presentation] Effect of nonylphenol on in vitro spermatogenesis of the critically endangered cyprinid Gnathopogon caerulescens (2022)
  • Author(s): Nishie T., Komaru A., Shiroguchi S., Yamaizumi T., Ono Y., Tooyama I., Fujioka Y., Sakai N., Higaki S., Takada T.
  • Organizer: 30th CECE & 9th ISFE Joint Conference of the European Society for Comparative Endocrinology and of the International Society for Fish Endocrinology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 琵琶湖固有魚ホンモロコ (Gnathopogon caerulescence) における免疫寛容 (rag2 変異) 個体の作製 (2020)
  • Author(s): 楠見憲一郎、佐川知優、藤本奈緒子、金森光紀、酒井優大、河﨑敏広、酒井則良、西江友美、高田達之
  • Organizer: 91回日本動物学会
• [Presentation] ビスフェノールAがゼブラフィッシュ発生時のレチノイン酸シグナルに及ぼす影響 (2020)
  • Author(s): 西江友美、吉村一輝、中本茉那、楠見憲一郎、加藤杏佳、舛友美緒、日比正彦、平澤明、高田達之
  • Organizer: 91回日本動物学会
• [Presentation] ゲノム編集による琵琶湖固有魚の免疫寛容個体作製 (2020)
  • Author(s): 楠見憲一郎、佐川知優、藤本奈緒子、金森光紀、酒井優大、河﨑敏広、酒井則良、西江友美、高田達之
  • Organizer: 第70回日本薬学会関西支部会
• [Remarks] 立命館大学薬学部
  • URL: https://www.ritsumei.ac.jp/~ttakada/%e7%b4%b0%e8%83%9e%e5%b7%a5%e5%ad%a6%e7%a0%94%e7%a9%b6%e5%ae%a4%e3%83%9b%e3%83%bc%e3%83%a0%e3%83%9a%e3%83%bc%e3%82%b8/Home.html
• [Remarks] 立命館大学細胞工学研究室
  • URL: http://www.ritsumei.ac.jp/~ttakada/%E7%B4%B0%E8%83%9E%E5%B7%A5%E5%AD%A6%E7%A0%94%E7%A9%B6%E5%AE%A4%E3%83%9B%E3%83%BC%E3%83%A0%E3%83%9A%E3%83%BC%E3%82%B8/Home.html
• [Remarks] 立命館大学研究者学術データベース
  • URL: https://research-db.ritsumei.ac.jp/rithp/k03/resid/S000553