| Project/Area Number |
20K06188
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40030:Aquatic bioproduction science-related
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
片岡 剛文 福井県立大学, 海洋生物資源学部, 准教授 (10533482)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
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| Keywords | 細菌捕食性原生生物 / 二者培養 / 餌細菌 / 増殖生理 / 原生生物 / 細菌摂食 / 比増殖速度 / 至適増殖温度 / 好気培養 / 日向湖 / 単離培養 / 従属栄養原生生物 / 生理生態学的試験 / 細菌摂食速度 |
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| Outline of Research at the Start |
水圏生態系では、原核生物（細菌）は溶存態有機物を炭素源として増殖し、原生生物に摂食され、原生生物は動物プランクトンに摂食される。つまり、細菌と原生生物の増殖および両者の食う食われるの関係は、生態系全体の有機物利用効率に関わるため物質循環における重要な過程である。
本研究では、原生生物の細菌摂食による有機物輸送過程を明らかにするために、まず、細菌摂食性原生生物を網羅的に単離する手法を開発する。得られた原生生物株の、増殖速度と摂食速度を計測し、環境中の細菌群集を餌とした擬似現場法の結果と比較する。これらを総合的に考察することで、微生物ループにおいて原生生物が有機物輸送に果たす役割を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
微生物ループを介した有機物輸送過程を再評価するために、環境中から細菌捕食性原生生物（BVP）と細菌を単離し、細菌捕食による原生生物への有機物輸送を定量的に再評価することが本研究の目的である。2023年度は、これまでに単離に成功し、多種多様な細菌種と共に維持培養（共培養）されているBVP株のうち3種（Euglenida sp. HJn10BC19株、Bicosoeca sp. HJn10c2株、Bicosoeca sp. HJn10c15株）について単一の細菌種を餌とする培養（二者培養）の作成を試みた。二者培養の作成には2022年度に用いた密度勾配遠心分離法と限界希釈法を組み合わせた手法を適用したが、密度勾配遠心分離処理後の原生生物の生存率が著しく低下するために、増殖可能な原生生物細胞数が細菌数を上回る分画を得ることができなかった。そこで、まず、濾過により細菌細胞と原生生物細胞を分離し、次に、顕微鏡下で無菌的に原生生物細胞を分取し単一の細菌株を含む培養へ移すことで二者培養の作成を試みた。原生生物が良好に増殖した培養液中のゲノムDNAを抽出し、細菌の分類指標となる16S rRNA遺伝子の細菌に共通な領域の塩基配列を調べたところ、HJn10BC19株、HJn10c2株、HJn10c15株の3種について、細菌株（Pseudoalteromonas sp. WB1株）の塩基配列のみが検出され、二者培養の作成に成功した。また、前年度に引き続き、これらの原生生物の分類指標となる18S rRNA遺伝子配列を公共のデータベースに登録するために分析を継続したが、PCR法とクローニング法を組み合わせた手法では、18S rRNA遺伝子の全長を得るには至らなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2022年度の方針を継続し、原生生物株と細菌株との二者培養を作成して増殖特性の定量を試みた。これまでの手法で、HJn10c19株と細菌WB1株の二者培養の作成を試みたところ、16S rRNA遺伝子配列は単一であったがWB1株とは異るVibrio sp.を含む二者培養であった。本二者培養の異なる温度下での比増殖速度を計測したところ、15℃で最小値、23℃で最大値であった。25℃（1.493±0.223 day-1）では、23℃と比べて低い値ではあったが有意差は認められなかったため至適増殖温度は20℃から27℃の間である。一方で、多様な細菌を含む場合の比増殖速度は、15℃と20℃では二者培養と違いはなかったが、25℃では0.960±0.158 day-1と低い値であった。細菌捕食性原生生物の比増殖速度は餌細菌種によって異なることが示唆されたが、その原因は不明であり今後の課題である。また、密度勾配遠心分離法と限界希釈法による二者培養化では、意図しない細菌が混入する可能性が新たな課題として挙げられた。
これらの欠点を改善するために、増殖可能な原生生物の細胞を分取することに注力して二者培養化を試みた。すなわち、まず、濾過により細菌細胞と原生生物細胞を分離し、次に、顕微鏡下で無菌的に原生生物細胞を分取し単一の細菌株を含む培養へ移すことで二者培養化を試みた。原生生物が良好に増殖した培養液中の16S rRNA遺伝子の塩基配列を調べたところ、HJn10BC19株、HJn10c2株、HJn10c15株の3種について、添加した細菌WB1株の塩基配列のみが検出され、二者培養の作成に成功した。
二者培養確立法の開発に労力を要したために、当初の予定であった原生生物株の摂餌生理に関する定量的な知見を得るには至らなかったため、やや遅れていると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、これまでに確立した原生生物の単離株の18S rRNA遺伝子塩基配列を決定し新規の系統については公共データベースに登録する。
2024年度は、主に原生生物の摂餌に関する定量的データを収集する。つまり、2022年度から2023年度にかけて得られた原生生物4株の細菌WB1株との二者培養において、異なる温度下での増殖速度試験を実施する。加えて本共培養についてWB株の細菌密度の1/10程度となるように直径が0.5 micro mの蛍光ポリスチレンビーズを添加して一定時間培養することで、WB1株が十分に増殖した状態での餌粒子の捕食速度を計測する。その後、直ちに細胞を回収・固定し蛍光顕微鏡下で細胞内のビーズを計測することでビーズ捕食速度および細菌摂食速度を計測する。
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