III型分泌機構に着眼したエドワジエラ症原因細菌の病原機構解析と新規予防法の開発

• Project/Area Number: 20K06211
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 40030:Aquatic bioproduction science-related
• Research Institution: Kagawa Prefectural College of Health Sciences
• Principal Investigator: 奥田 潤 香川県立保健医療大学, 保健医療学部, 教授 (90334276)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂井 貴光 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 主任研究員 (50416046) ; 末澤 千草 香川県立保健医療大学, 保健医療学部, 講師 (90331868) ; 河東 康彦 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 主任研究員 (90634220) ; 中川 徹優 国立研究開発法人水産研究・教育機構, 水産技術研究所(南勢), 研究員 (40884656)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000); Fiscal Year 2023: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2022: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2020: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
• Keywords: Edwardsiella piscicida / III型分泌機構 / 機能未知エフェクター候補遺伝子 / 生菌ワクチン / 感染制御 / 結合宿主因子 / ワクチン / III 型分泌装置遺伝子 / orf13, orf19

Outline of Research at the Start

エドワジエラ症は Edwardsiella 属細菌による感染症の総称で、特にヒラメ、マダイ、ウナギの養殖における魚病被害では一番の問題となっている。本菌にはIII 型分泌装置と呼ばれる針のようなタンパク質輸送装置が存在し、前申請研究でIII 型分泌装置から分泌される２つの遺伝子(orf13及びorf19)がヒラメの病原性に関与することを明らかにした。本研究では両遺伝子に着目し、分子生物学的な解析を進めることにより、III 型分泌装置を介した本菌の未知の病原性発現機構を明らかにする。一方で両遺伝子ノックアウト株を生菌ワクチンとして利用することで本菌による魚類エドワジエラ症の予防法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

前申請研究（基盤 C、16K07849）で、申請者らは E. piscicida の III 型分泌装置に着目し、２つの機能未知エフェクター候補遺伝子がヒラメの病原性に大きく関与することを明らかにした。
本申請研究では、ヒラメに対する病原性が著しく減弱化した２つの機能未知エフェクター候補遺伝子ノックアウト株を生菌ワクチンとして利用することで、E. piscicida によるヒラメのエドワジエラ症の新規の予防法の開発を目指したいと考えるが、これまで申請者らが用いてきた２つの機能未知エフェクター候補遺伝子ノックアウト株には生菌ワクチンとして利用するには、大きな問題点があると思われる。すなわち、この２つのノックアウト株は薬剤耐性遺伝子を含むトランスボゾン挿入変異株であることから、薬剤耐性遺伝子を含まないin-frameノックアウト株を作製し、ヒラメに対する生菌ワクチンとしての可能性を検討する必要がある。
昨年度は、ノックアウト株の作製に必要な標的遺伝子を削除した遺伝子断片の、自殺ベクターへのクローニングを完了した。
今年度は、接合により標的遺伝子を削除した遺伝子断片を含む自殺ベクターを野生株に移し、相同組み換えを起こさせることで、最終的なin-frameノックアウト株の単離に成功した。また、ウエスタンブロットで必要となる２つの機能未知エフェクターに対するウサギポリクローナル抗体の作製も、スクラム（株）に受託し完成させた。
次年度は、単離した２つの機能未知エフェクター候補遺伝子のin-frameノックアウト株について、ゲノム上からターゲット遺伝子が削除されていることを塩基配列のシークエンス解析で確認し、さらに作製した抗体を用いたウエスタンブロットでターゲットタンパク質の発現が消失していることを確認することで、in-frameノックアウト株の完成を目指したい。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

E. piscicida の２つの機能未知エフェクター候補遺伝子のin-frameノックアウト株の作製に、従来の大腸菌の自殺ベクターを用いた方法が適用可能なことが報告されたことから (Edrees A et al, J Fish Dis, 2018)、申請者らも従来、緑膿菌で用いてきた大腸菌のin-frameノックアウト法 (Okuda J et al, Infect Immun, 2010) を E. piscicida のノックアウト株作製に適用したところ、時間はかかったが、工夫を重ねることで２つの機能未知エフェクター候補遺伝子のノックアウト株の単離に成功した。
また、ウエスタンブロットで必要となる２つの機能未知エフェクターに対するウサギポリクローナル抗体の作製も、スクラム（株）に受託し完成させた。

Strategy for Future Research Activity

E. piscicida の２つの機能未知エフェクター候補遺伝子のin-frameノックアウト株の作製を、出来るだけ早期に完了させたい。ノックアウト株の作製が完了次第、分担者が所属する水産技術研究所にノックアウト株を送り、ヒラメを用いた感染実験を行う予定である。また、ヒラメ由来の cDNA ライブラリーを構築し、両遺伝子について yeast-two hybrid 法による結合宿主因子のスクリーニングを行いたい。