複雑脳発生を明らかにする新規組み換え酵素ノックイン技術の開発

• Project/Area Number: 20K06464
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 恒川 雄二 東京大学, 医科学研究所, 助教 (80733352)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2022: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000); Fiscal Year 2020: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: LsCre / AAV / Creノックイン / Cre de novo ノックイン / ノックイン / リコンビネース

Outline of Research at the Start

ヒト型のシワのある大脳皮質がどのように発生するかを明らかにするにはマウス以外の高等哺乳類モデル動物を使う必要がある。しかし、それらの動物ではコンディショナルノックアウト (cKO)、リニエージトレーシング、機能獲得実験などの基本技術に必須であるリコンビネースをノックインすることができない。本研究では申請者の開発した体細胞に対するゲノム編集技術を改良し、食肉目のフェレットを複雑脳モデルとして、発生期においてcKO、リニエージトレーシング、細胞特異的機能獲得実験を可能にするCre-LoxPシステムの適用を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

遺伝子工学的に細胞特異的な遺伝子発現をさせるためのノックイン（KI）モデル動物の作製が困難な生物種に対応できるように、さまざまな動物種において細胞特異的な遺伝子発現を実現する技術の開発を目指した。生後の動物においてde novo ノックインを行う際、ドナーとして細胞内に導入したCreが意図せず発現してしまい（リーク）、目的以外の細胞で遺伝子が発現してしまう現象が観察された。そこで、ノックインされるまでドナーから非特異的な遺伝子発現を抑えるためにコドン改変を行ったリークレスCre（LsCre）を開発した。LsCreはプラスミドを用いた電気穿孔法によるin vivo 遺伝子導入では予想通りリークしないことが確認された。次に狭い範囲でしか遺伝子導入できない電気穿孔法ではなく、全身で遺伝子導入のできるアデノ随伴ウイルス（AAV）にLsCreを組み込んで、in vivo 遺伝子導入を行った。その際に効率的にAAVを製造、精製する技術開発も行い、報告した。AAVにLsCreを組み込んでin vivo 遺伝子導入を行ったところ、予想外のリークが引き起こされる事実が新たに発見された。これは、AAVが発現する際に細胞内でコンカテマーと呼ばれる環状のDNA複合体を形成するためではないかと現在予想されている。今後はAAVにおいてもリークしない新たなLsCreの開発を進めていく。

Research Products

• [Journal Article] Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor (2023)
  • Author(s): Wada M, Uchida N, Posadas-Herrera G, Hayashita-Kinoh H, Tsunekawa Y, Hirai Y, Okada T.
  • Journal Title: Gene Therapy Volume: Mar 28 Issue: 7-8 Pages: 641-648
  • DOI: 10.1038/s41434-023-00398-x
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a novel purification method for AAV vectors using tangential flow filtration (2023)
  • Author(s): Miyaoka Rimi、Tsunekawa Yuji、Kurosawa Yae、Sasaki Takako、Onodera Azusa、Sakamoto Kenji、Kakiuchi Yuko、Wada Mikako、Nitahara‐Kasahara Yuko、Hayashita‐Kinoh Hiromi、Okada Takashi
  • Journal Title: Biotechnology and Bioengineering Volume: 120 Issue: 11 Pages: 3311-3321
  • DOI: 10.1002/bit.28524
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Engineering a highly durable adeno-associated virus receptor for analytical applications (2023)
  • Author(s): Yoshida Kouhei、Tsunekawa Yuji、Kurihara Kento、Watanabe Kazuya、Makino-Manabe Yuriko、Wada Mikako、Tanaka Toru、Ide Teruhiko、Okada Takashi
  • Journal Title: Molecular Therapy - Methods & Clinical Development Volume: 31 Pages: 101157-101157
  • DOI: 10.1016/j.omtm.2023.101157
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] LONRF2 is a protein quality control ubiquitin ligase whose deficiency causes late-onset neurological deficits (2023)
  • Author(s): Li Dan、Johmura Yoshikazu、Morimoto Satoru et al.
  • Journal Title: Nature Aging Volume: 3 Issue: 8 Pages: 1001-1019
  • DOI: 10.1038/s43587-023-00464-4
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Subcellular mRNA localization and local translation of Arhgap11a in radial glial progenitors regulates cortical development (2023)
  • Author(s): Pilaz LJ, Liu J, Joshi K, Tsunekawa Y, Musso CM, D'Arcy BR, Suzuki IK, Alsina FC, Kc P, Sethi S, Vanderhaeghen P, Polleux F, Silver DL.
  • Journal Title: Neuron . Volume: 111(6) Issue: 6 Pages: 839-856
  • DOI: 10.1016/j.neuron.2023.02.023
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] ウイルスの精製方法 (2022)
  • Inventor(s): 恒川雄二
  • Industrial Property Rights Holder: 恒川雄二
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Industrial Property Number: 2022-047745
  • Filing Date: 2022