複雑脳発生を明らかにする新規組み換え酵素ノックイン技術の開発
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20K06464
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42040:Laboratory animal science-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
恒川 雄二 東京大学, 医科学研究所, 助教 (80733352)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2020: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | LsCre / AAV / Creノックイン / Cre de novo ノックイン / ノックイン / リコンビネース |
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| Outline of Research at the Start |
ヒト型のシワのある大脳皮質がどのように発生するかを明らかにするにはマウス以外の高等哺乳類モデル動物を使う必要がある。しかし、それらの動物ではコンディショナルノックアウト (cKO)、リニエージトレーシング、機能獲得実験などの基本技術に必須であるリコンビネースをノックインすることができない。本研究では申請者の開発した体細胞に対するゲノム編集技術を改良し、食肉目のフェレットを複雑脳モデルとして、発生期においてcKO、リニエージトレーシング、細胞特異的機能獲得実験を可能にするCre-LoxPシステムの適用を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度はLsCreを細胞およびマウスに投与するためAAVにパッケージングし、In vitro およびIn vivoでのLsCreのノックインを試みた。マウス大脳皮質にCas9発現カセット、Cre レポーター（CAG-Flox-Stop-EGFP）カセット、gRNA発現カセットおよびドナー用LsCreを搭載したAAVを共導入し、In vivoでのノックインを試みた。その結果、Cas9を共導入しなかった場合でも、Cre レポーターからEGFPの発現が確認され、プラスミドでは抑え込めていたLsCreのリークが何故かAAVでは抑え込めないことが新たにわかった。
なぜ、プラスミドでは抑え込めていたLsCreのリークがAAVでは抑え込めないのかを明らかにするため、培養細胞にLsCreプラスミドを導入した群とLsCreAAVを感染させた群からmRNAを採取し、5'RACEを行い発現しているmRNAを確認した。その結果、LsCreAAVを感染させた群ではLsCre配列の上流にLsCreの配列が繰り返し確認された。これはAAVがエピソーマルに遺伝子を発現する場合ITRを介して環状のコンカテマーを形成することが原因を考えられ、この結果、LsCre上流にプラスミドではあらわれないプロモーター活性を持つ余分な配列が挿入されてしまったことによりリークが起こってしまっていることが確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
今年度行ったAAVを用いたLsCreのIn vivo ノックイン実験の結果、プラスミドでは完璧に抑え込めていたCre活性のリークが何故かAAVでは抑え込めないことが新たに明らかになった。5'RACEなどの実験の結果、LsCreAAVを感染させた群ではLsCre配列の上流にLsCreの配列が繰り返し確認された。これはAAVがエピソーマルに遺伝子を発現する場合ITRを介して環状のコンカテマーを形成することが原因を考えられ、この結果、LsCre上流にプラスミドではあらわれないプロモーター活性を持つ余分な配列が挿入されてしまったことによりリークが起こってしまっていることが確認された。
以上の結果は本研究課題が採択されたときには予想されなかったものであり、結果、進行状況は予定より遅れていると考えた。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在までの実験結果から得られた仮説では、AAVがエピソーマルに遺伝子を発現する際にITRを介して形成するコンカテマーが原因でリークが起こっていると考えられる。これは、ITR以外のAAVパッケージングシグナルを用いた場合リークを防ぐことができる可能性を示唆している。現在、ITRの一部であるADドメインのみを使ったAAVへのパッケージングを試みており、ADドメインでLsCreをパッケージングした場合、LsCreがIn vivoでもリークしないかを確認中である。今後は、このようにAAVで導入された遺伝子がコンカテマーを作らないような方法でLsCreをIn vivoでノックインできないかを検討していく予定である。
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Report
(3 results)
Research Products
(3 results)
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[Journal Article] Subcellular mRNA localization and local translation of Arhgap11a in radial glial progenitors regulates cortical development2023
Author(s)
Pilaz LJ, Liu J, Joshi K, Tsunekawa Y, Musso CM, D'Arcy BR, Suzuki IK, Alsina FC, Kc P, Sethi S, Vanderhaeghen P, Polleux F, Silver DL.
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Journal Title
Neuron .
Volume: 111(6)
Issue: 6
Pages: 839-856
DOI
Related Report
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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