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Development and dissemination of unroof and perforation methods for cryo-EM and AFM

Research Project

Project/Area Number 20K06586
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 43040:Biophysics-related
Research InstitutionNagoya University

Principal Investigator

Usukura Jiro  名古屋大学, 未来材料・システム研究所, 名誉教授 (30143415)

Project Period (FY) 2020-04-01 – 2024-03-31
Project Status Completed (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywordsアンルーフ法 / unroofing / 膜細胞骨格 / アクチン線維 / 細胞膜 / インフルエンザAウイルス / genom packaging / 電子顕微鏡 / 原子間力顕微鏡 / ゲノムパッケージング / 免疫フリーズエッチング電顕 / インフルエンザ / クライオ電子顕微鏡 / 細胞骨格 / インフルエンザウイルス / アクチン / フリーズエッチング / フリーズエッチング法 / 小胞体 / クライオ電顕
Outline of Research at the Start

アンルーフ法は物理的に細胞膜を剥離し、細胞質を流出させ、細胞膜の細胞質側表面を露出させ、膜細胞骨格を観察するための前処理法である。超音波を利用する方法(Sonication unroofing)とAlcian blueで粘着処理したグリッドによる引き剥がし法(peel off unroofing)がある。本研究はアンルーフのメカニズムを解明し、効率の良いプロトコールを作り、原子間力顕微鏡(AFM)やクライオ電顕観察への応用を容易にすることと、この技術を次世代に引き継がせることである。

Outline of Final Research Achievements

This study aims to develop, improve and disseminate the unroofing method, a sample preparation method for exposing the cytoplasmic surface of the cell membrane and observing the membrane cytoskeleton attached to it in three dimensions by electron microscopy and AFM. Three unroofing methods, the sonication, adhesion and perforation methods, were developed and improved during the research period.
We used this method to visualise the influenza A infection cycle. Ribonucleoproteins (vRNPs) containing the replicated genome were found to accumulate on the cytoplasmic side surface of the plasma membrane, where vRNPs are packaged for the formation of progeny viruses exploiting the motility of host plasma membrane cytoskeletal actin fibres (under submission).

Academic Significance and Societal Importance of the Research Achievements

細胞膜は細胞の内外を隔てるだけでなく、内外の積極的な情報交換の場でもある。ウイルスなどの病原体もレセプターを介して、膜の飲食作用により取り込まれる。言わば生命現象の最前線でもある。細胞膜の細胞質側表面の構造を立体的に観察できるようなったことは学術的に極めて有意義なことである。また、我々の応用研究からA型インフルエンザの子孫ゲノムが細胞膜の細胞質側表面に集積し、そこでパッケージングされ子孫ウイルスとして排出されることが分かった。これはインフルエンザ感染症の対策や創薬にとって重要な知見であり、社会的にも重要な研究である。

Report

(5 results)
  • 2023 Annual Research Report   Final Research Report ( PDF )
  • 2022 Research-status Report
  • 2021 Research-status Report
  • 2020 Research-status Report
  • Research Products

    (8 results)

All 2023 2022 2021 2020

All Journal Article (5 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 5 results,  Open Access: 3 results) Presentation (3 results)

  • [Journal Article] 原子間力顕微鏡で細胞を見る2022

    • Author(s)
      臼倉治郎
    • Journal Title

      膜

      Volume: 47 Pages: 2-9

    • Related Report
      2022 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] 原子間力顕微鏡で細胞膜を見る2022

    • Author(s)
      臼倉治郎
    • Journal Title

      膜

      Volume: 47 Pages: 2-9

    • NAID

      130008159625

    • Related Report
      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] A cryo-TSEM with temperature cycling capability allows deep sublimation of ice to uncover fine structures in thick cells2021

    • Author(s)
      Usukura Jiro、Narita Akihiro、Matsumoto Tomoharu、Usukura Eiji、Sunaoshi Takeshi、Watanabe Syunya、Tamba Yusuke、Nagakubo Yasuhira、Mizuo Takashi、Azuma Junzo、Osumi Masako、Nimura Kazutaka、Tamochi Ryuichiro、Ose Yoichi
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Issue: 1 Pages: 21406-21406

    • DOI

      10.1038/s41598-021-00979-z

    • Related Report
      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] A prospective mechanism and source of cholesterol uptake by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes co-cultured with HepG2 cells2021

    • Author(s)
      Eri H Hayakawa, Hirotomo Kato, Glenn A Nardone, Jiro Usukura
    • Journal Title

      Parasitology International

      Volume: 80 Pages: 102179-102179

    • DOI

      10.1016/j.parint.2020.102179

    • Related Report
      2021 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Improved unroofing protocols for cryo-electron microscopy, atomic force microscopy and freeze-etching electron microscopy and the associated mechanisms2020

    • Author(s)
      Morone Nobuhiro、Usukura Eiji、Narita Akihiro、Usukura Jiro
    • Journal Title

      Microscopy

      Volume: 69 Issue: 6 Pages: 350-359

    • DOI

      10.1093/jmicro/dfaa028

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] インフルエンザAウイルスのゲノムパッケージングにおけるアクチン膜細胞骨格の役割2023

    • Author(s)
      臼倉治郎
    • Organizer
      日本顕微鏡学会第79回学術講演会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report
  • [Presentation] 細胞膜内表面上のアクトミオシンによるインフルエンザAウイルスのゲノムパッケージング2023

    • Author(s)
      臼倉 治郎, Wang I-Hsuan, 三宅康之, 臼倉 英治, 成田 哲博, 山内 洋平, 河岡 義裕
    • Organizer
      日本解剖学会
    • Related Report
      2023 Annual Research Report 2022 Research-status Report
  • [Presentation] AFM live-cell imaging と免疫freeze etching電顕によるインフルエンザ感染過程の解析2022

    • Author(s)
      臼倉 治郎, Wang I-Hsuan , 臼倉 英治, 成田 哲博, 山内 洋平, 河岡 義裕
    • Organizer
      日本顕微鏡学会
    • Related Report
      2022 Research-status Report

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Published: 2020-04-28   Modified: 2025-01-30  

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