TCA回路で形成される代謝酵素複合体の進化起源の解明

• Project/Area Number: 20K06608
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43060:System genome science-related
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 亀谷 将史 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (80748517)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石井 正治 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (30193262)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2022: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000); Fiscal Year 2020: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: TCA回路 / rTCA回路 / 代謝複合体 / 炭酸固定

Outline of Research at the Start

代謝酵素複合体とは、ある代謝系を構成する酵素群が形成する複合体を指し、中間代謝物の拡散防止など多くの代謝の効率向上に寄与することが知られている。TCA回路においても代謝酵素複合体の存在が知らるが、その進化的起源は不明である。本研究では、TCA回路を逆回転させ二酸化炭素を固定するreductive TCA (rTCA)回路でも複合体は形成されるか、またその機能を明らかにする。これにより、炭酸固定を効率的に進めるための機構を明らかにする。さらに、rTCA回路がTCA回路の祖先型であるという進化関係に着目し、TCA回路の代謝酵素複合体の起源やその進化過程の理解を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

代謝酵素複合体とは、ある代謝系を構成する酵素群が細胞内で形成する複合体である。多くの生物の代謝の根幹として機能するTCA回路においても代謝酵素複合体が形成されることが知られているが、その進化的起源は明らかになっていない。
本研究では、TCA回路を逆回転させた二酸化炭素固定経路、reductive TCA (rTCA)回路における複合体形成の有無やその機能を明らかにする。これにより、炭酸固定というエネルギー的に不利な代謝を進めるために複合体形成が寄与しているかを明らかにすると共に、rTCA回路酵素を用いた物質生産に資する知見を得る。さらに、rTCA回路がTCA回路の祖先型代謝であるという進化的関係に着目し、rTCA回路にとどまらずTCA回路の代謝酵素複合体の起源を明らかにし、生物普遍的な中央代謝系であるTCA回路の進化過程全貌の理解を目指す。
これまでに、細胞抽出液の分画による複合体形成の検出を試みた。rTCA回路を有する微生物Hydrogenobacter thermophilus TK-6を培養し、その細胞抽出液を調製後、ゲル濾過カラムなどによる分画を行った。得られた過分を用い、rTCA回路を構成する各種酵素の活性を測定を行い、高分子画分で複合体と推測される活性が検出されるかを検証した。また、各酵素に特異的な抗体を作製し、Western blottingによる高感度検出を可能とした。さらに、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させ、それと複合体を形成するタンパク質の取得を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまでに細胞抽出液の分画による複合体形成検出実験を終えた。さらに個々の酵素に特異的な抗体を作製し、Western blottingによる高感度検出を可能とした。さらに、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させ、それと複合体を形成するタンパク質の取得を進めている。また、rTCA回路中の酵素にアフィニティ精製タグを付けて発現させるための組換え用のプラスミドを作製にも成功し、いずれの酵素でも活性型酵素が得られた。これら抗体と組換え酵素を組み合わせ、複合体を形成するタンパク質の検出・取得を進めている。

Strategy for Future Research Activity

アフィニティ精製タグを付加した組換えタンパク質を用い、in vitroでの複合体形成の有無を確かめる実験を進める。Western blottingによる高感度検出に加え、MALDI TOF-MSによる解析などでそのタンパク質同定を進め、複合体形成に関与するタンパク質の同定を進める。