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臨床応用を目指す高効率・高精度なCRISPRノックイン法の確立

Research Project

Project/Area Number 20K06613
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (C)

Allocation TypeMulti-year Fund
Section一般
Review Section Basic Section 43060:System genome science-related
Research InstitutionAichi Medical University

Principal Investigator

小西 裕之  愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 兵頭 寿典  愛知医科大学, 医学部, 講師 (40710645)
Project Period (FY) 2020-04-01 – 2025-03-31
Project Status Granted (Fiscal Year 2020)
Budget Amount *help
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
Keywordsゲノム編集 / ノックイン / CRISPR / Cas9 / nickase / tandem paired nicking / Cas9 nickase
Outline of Research at the Start

CRISPR/Cas9によるノックインは狙った遺伝子の自在な改変を可能にするが、Cas9標的部位やその他の部位の高頻度なランダム変異(Indels)を伴う。しかし申請者らは、Cas9 nickaseを用いたTandem Paired Nicking法(TPN法)によって従来と概ね同等のノックイン効率を維持しつつランダム変異を著減できることを示した。しかしTPN法のノックインがなぜ、どのように起きるのかは、その制御機構も含めて不明である。そこで本研究では、複数の内在性遺伝子を用いたアッセイ系などによって、同法のノックインがどのような行程で起きるのかを調べ、その分子機序を解析する。得られた知見を利用してノックイン効率の向上を目指し、臨床応用への道を開く。

Outline of Annual Research Achievements

Tandem Paired Nicking法(TPN法)は、当研究グループが数年来にわたって研究してきたCas9 nickaseを用いるノックインの手法である。通常のCas9 nucleaseを用いるノックインでは、ゲノムDNAに二重鎖切断が導入され、細胞の相同組換え修復機構が起動することによってドナーDNAとの相同性に基づく組換え(すなわちノックイン)が起きる。それに対し、TPN法では、2個のCas9 nickaseがゲノムDNA二重鎖のうちの同一の鎖に2個のニックを導入するが、DNA二重鎖切断は導入しない。一方、Cas9 nickaseの標的配列が相同領域内に設置されるため、ドナーDNAにもゲノムDNAと同所性のニックが導入される。すなわち2個のCas9 nickaseによって合計4個のニックが導入され、それによってゲノムDNAとドナーDNAの相同性に基づく組換えが起きる。
このようなニック導入様式によって相同性に基づくDNA組換えが誘導される事例の報告は現在まで多くない。そのため、どのような分子メカニズムがこの組換えを駆動するのか、どのような実験条件がTPN法のノックイン効率を決定するのかなどが未解明のまま残されている。本研究では、このような疑問に対する解明の端緒を探るため、ゲノムDNA上の編集対象遺伝子におけるCas9 nickase標的配列の選定、ドナーDNAの設計・準備条件などについて検討を進める計画である。
当研究グループでは、TPN法のノックイン効率を計測するための内在性遺伝子に基づくアッセイ系として、これまでヒトPIGA遺伝子(X染色体)を使用してきた。具体的には、ヒト男性由来の培養細胞株が持つPIGA遺伝子に点変異(不活化変異)をノックインし、これをTPN法で修復してその効率をフローサイトメトリーで計測する方法を採用してきた。本研究の初年度は、ヒト細胞株の内在性遺伝子に基づく別のアッセイ系の樹立を目標として、下記「現在までの進捗状況」に記載した通りの研究展開を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

初年度の研究目標を達成するための具体策として、ヒト細胞株において、まず常染色体上にあるPIGP遺伝子の一方のアレルにキロベース単位の大規模欠失を導入し、続いて他方のアレルに点変異(不活化変異)を導入した。完成した細胞クローンに対してTPN法によるPIGP遺伝子修復を行い、その効率をフローサイトメトリーによって定量的に計測しうることを確認した。
新型コロナウイルス感染拡大状況に起因する研究活動の制限、研究資材の調達の遅れなどのため、期待していた最大限の研究の進展は達成できなかった。しかしアッセイ系の樹立というひとつのサブテーマを完了することができた。

Strategy for Future Research Activity

TPN法による高効率なノックインを達成しうるCas9 nickase標的の配列・位置に関する条件の検討、至適なドナーDNAの長さに関する詳細な検討、TPN法に必要な分子ツールを細胞内導入するときの実験的条件などについて検討を行う予定である。新型コロナウイルス感染拡大防止に十分に留意しつつ研究を推進する。

Report

(1 results)
  • 2020 Research-status Report
  • Research Products

    (5 results)

All 2021 2020

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 2 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 3 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] CD52 is a novel target for the treatment of FLT3-ITD-mutated myeloid leukemia2021

    • Author(s)
      Karnan S, Hanamura I, Ota A, Takasugi S, Nakamura A, Takahashi M, Uchino K, Murakami S, Wahiduzzaman M, Vu LQ, Rahman ML, Hasan MN, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Yoshikawa K, Suzuki S, Ueda R, Ejiri M, Hosokawa Y, and Takami A
    • Journal Title

      Cell Death Discov

      Volume: -

    • Related Report
      2020 Research-status Report
  • [Journal Article] Identification of CD24 as a potential diagnostic and therapeutic target for malignant pleural mesothelioma2020

    • Author(s)
      KarnanS, Ota A, Murakami H, Rahman ML, Hasan  MN, Wahiduzzaman MD, Hanamura I, Vu LQ, Inoko A, Hyodo T, Konishi H, Tsuzuki S, Hosokawa Y.
    • Journal Title

      Cell Death Discovery

      Volume: 18 Issue: 1 Pages: 127-139

    • DOI

      10.1038/s41420-020-00364-1

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Novel Interleukin-6 Inducible Gene PDZ-Binding Kinase Promotes Tumor Growth of Multiple Myeloma Cells2020

    • Author(s)
      Ota Akinobu、Hanamura Ichiro、Karnan Sivasundaram、Inaguma Shingo、Takei Norio、Lam Vu Quang、Mizuno Shohei、Kanasugi Jo、Wahiduzzaman Md、Rahman Md Lutfur、Hyodo Toshinori、Konishi Hiroyuki、Tsuzuki Shinobu、Ikeda Hiroshi、Takami Akiyoshi、Hosokawa Yoshitaka
    • Journal Title

      Journal of Interferon & Cytokine Research

      Volume: 40 Issue: 8 Pages: 389-405

    • DOI

      10.1089/jir.2020.0111

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Journal Article] Targeting MEF2D-fusion Oncogenic Transcriptional Circuitries in B-cell Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia2020

    • Author(s)
      Shinobu Tsuzuki, Takahiko Yasuda, Shinya Kojima, Masahito Kawazu, Koshi Akahane, Takeshi Inukai, Masue Imaizumi, Takanobu Morishita, Masashi Sanada, Hideki Muramatsu, Yoshiyuki Takahashi, Yasushi Miyazaki, Itaru Matsumura, Hitoshi Kiyoi, Yoshitaka Hosokawa, Hiroyuki Mano, Fumihiko Hayakawa
    • Journal Title

      Blood Cancer Discovery

      Volume: 1 Issue: 1 Pages: 82-95

    • DOI

      10.1158/2643-3230.bcd-19-0080

    • Related Report
      2020 Research-status Report
    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Book] ゲノム編集技術を応用した製品開発とその実用化2021

    • Author(s)
      執筆者:96名、技術情報協会
    • Total Pages
      602
    • Publisher
      技術情報協会
    • ISBN
      9784861048272
    • Related Report
      2020 Research-status Report

URL: 

Published: 2020-04-28   Modified: 2024-12-25  

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