| Project/Area Number |
20K06618
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44010:Cell biology-related
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| Research Institution | Ochanomizu University |
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Principal Investigator |
岸本 健雄 お茶の水女子大学, サイエンス&エデュケーション研究所, 客員教授 (00124222)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥村 英一 東京工業大学, 生命理工学院, 助教 (00323808)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 細胞周期制御 / 卵細胞 / 細胞内情報伝達 / 卵成熟誘起ホルモン受容体 / cyclin B-Cdk1 |
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| Outline of Research at the Start |
卵細胞における細胞周期制御の特徴は、細胞外刺激に連携している点にある。本研究では、未成熟卵細胞周期のG2/M期移行をもたらすために、いかにして卵外からの卵成熟誘起ホルモン刺激が伝達されるのかを解明する。申請者らにより卵成熟誘起ホルモンの刺激を卵表で受容したあとの分子経路はほぼ明らかになっているので、本計画では卵成熟誘起ホルモン受容体の同定に焦点をあてる。これにより、全動物卵を通じて初めて、G2/M期移行に至る卵成熟誘起ホルモン・シグナリングの全容を判明させたい。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本計画では、ヒトデの卵成熟誘起ホルモンである1-methyladenine (1-MeAde) の卵表受容体の分子実体を同定し、卵成熟誘起ホルモンによるG2/M期移行シグナリングの全容を全動物で最初に判明させることを目指している。事前研究から、この卵表受容体と期待されるGPCR (G protein-coupled receptor) のcDNAを一つに絞ることができているので、このcDNAがコードするタンパク質（候補GPCR）がまさに目指している分子であることを確証したい。そのために、本年度は以下の実験を実施した。
(1) 候補GPCRのC末テイル部機能ドメイン（リン酸化部位）に対する抗体による機能阻害を試みた（内在性タンパクの認識は確認済み）。卵内に微小注射した抗体は、対照実験（IgG）に比べて、わずかではあるが再現性をもって阻害効果を示した［20分ほどで見られるGVBD（G2/M期移行のマーカー）に平均5-6分の遅れ］。なお、抗体の微小注射実験については、「７．現在までの進捗状況」も参照。
(2) 候補GPCRの機能不全型変異体（C末端欠損型）mRNAを卵内で発現させ、競争阻害を試みた。正常型と比べて、1-MeAde作用に対する効果にわずかな差があった（機能不全型では数分のGVBDの遅れ）。しかし、この結果には、更なる検証が必要と考えている。
(3) 1-MeAdeが卵成熟誘起効果を発揮するには閾値があることは従来から知られているが、閾値以下の濃度の1-MeAde処理がCdk1-T161のリン酸化を促進し、その結果、cyclin B-Cdk1の複合体（G2/M期移行の引金分子）形成が促進されることが、新たに分担研究者（奥村英一）によって見出された。これは、1-MeAde受容体の同定に限らず、1-MeAde刺激の伝達システム解明への新規で大きな手掛かりとなるに違いない。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初年度以来、候補GPCRの細胞内機能ドメインに対する各種抗体を卵内に微小注射して、内在性候補GPCRの機能を阻害することを試みてきた。しかし常に、十分量の抗体が卵表層に達していない可能性が危惧されていた。そこで、抗体を表層に集積させることが期待される道具（myr-ZZ-Hisx6）を設計した。ところが、結果的には、この道具はmRNAとin vitro合成タンパクのどちらを卵内に導入しても卵細胞において毒性を示すことが判明し、使用を断念せざるを得なくなった。この結論に至るまで、かなりの労力と時間を要したため、研究の進展を遅らせることとなった。コロナも一応収束して、実験を実施できるようになったのはよかったが、この道具については残念な結末であった。
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| Strategy for Future Research Activity |
毎年度述べていることであるが、「候補GPCRの機能阻害による必要性の証明」こそが、本研究計画での最重要課題である。しかし、これまでの実験結果は、それを示唆はしても、決定的な証明とは言い難いのも確かである。来年度は本研究計画の本当の最終年度ではあり、このままで論文の公表に進めるかどうかを、厳しく検討したい。もちろん、ヒトデ卵に適用可能な新たな機能阻害法があれば、ぜひともそれを実施したい。
一方、今年度の「５．研究実績の概要」の末尾で述べた閾値以下の1-MeAdeによるCdk1-T161のリン酸化とcyclin B-Cdk1の複合体形成の促進は、それをもたらす分子機構だけでなく、閾値以下の濃度の 1-MeAdeでもcyclin B-Cdk1は一旦は低レベルに活性化されるがすぐに不活化されるという我々の以前の報告（Hiraoka et al., J. Cell Sci., 2016）と相まって、本研究計画のタイトルである「卵成熟誘起ホルモン刺激の伝達によるG2/M期移行」について、根本的な課題を新たに提供するものである。すなわち、1-MeAdeの受容体は果たして一種類に限られるのか、たとえ一種類であっても応答の引き起こし方は閾値以下と以上で異なるのか、等の疑問である。本計画の実施から、新たな科研費申請の中心課題が見えてきたといえる。
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