| Project/Area Number |
20K06749
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44050:Animal physiological chemistry, physiology and behavioral biology-related
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
山本 博章 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 客員教授 (40174809)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
田村 勝 国立研究開発法人理化学研究所, バイオリソース研究センター, 室長 (50370119)
矢嶋 伊知朗 芝浦工業大学, システム理工学部, 教授 (80469022)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000)
Fiscal Year 2022: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 毛色 / 毛周期 / マウス / 乾癬遺伝子 / 毛周期時計 |
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| Outline of Research at the Start |
毛の再生等、比較的長い周期を持つ生命現象の機構解明は進んでいない。申請者らは、数回の毛の生え変わり(毛周期)後から、それ以降の再生ごとに毛色を交互に変更し、1本の毛にも異なるメラニンの繰り返しパターンを発現できるマウス変異体を発見した。この原因遺伝子はヒト乾癬の1原因遺伝子であるCARD14遺伝子のオルソログであり、coiled-coilドメインをコードする部位に変異を持つ。本研究は、Card14とメラニン合成の鍵酵素・チロシナーゼの発現解析を時系列で行い、また当該遺伝子産物の変異サイトと相互作用する因子の解明を行うことによって、長い周期を持つ毛周期の分子機構解明に資する基盤とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物が示す周期性は長く科学者の興味の対象となってきた。概日周期等に比して、哺乳類が示す毛の再生周期等、比較的長い周期を示す生命現象の分子機構解明にはまだ多くの課題が残っている。
我々は、毛色変化を周期的に繰り返すマウス変異体を利用して、当該研究の端緒にしようとした。終生黒毛色を発現する遺伝的背景を持つこの変異体は、生後黒色の毛を数回生え変わらせた後に、淡い毛色に変化し、以後毛の生え変わり（約30日周期）に連関して濃淡の毛色を交互に発現する。変異表現型の可視的判定には12週間前後必要で（生後すぐに判定できない）、マッピングには長期間を要したが、その結果は、当該責任遺伝子が、ヒト乾癬の1原因遺伝子であるCARD14遺伝子のオルソログであり、ヒトでもこれまで報告のほとんどない特異な部位の変異が原因となっていることを示していた。この変異系統とゲノム編集マウスから得られた複数のアレルを利用しながら、前記の機構解明に取り掛かろうとした。
上記変異アレルは多くがホモ接合体において致死性を示し、点突然変異や短い挿入・欠失、さらには比較的大きな欠失を含むものもある。これらを生後早期に判別できるPCR法を構築したが、それぞれの系統の繁殖率の低さに苦労してきた。現在はオリジナルの点突然変異体と長い欠失を持つ2系統をライブで維持できている（他は精子の凍結保存を行った）。
アレルの配列解析は、Card14タンパク質のコイルドコイル部分が上記現象に重要な役割を果たしていることを予想させた。そこで、Card14相互作用因子の解析を抗体を用いて進めようとしたが、まだハードルを越えられないでいる。市販の抗体、また配列情報を基に作成したオーダーメイドの抗体標品、いずれを用いても満足な結果が得られていない。加えて、試料として皮膚組織だけでなく、培養細胞系も構築したが、その効率化にも困難をきたしている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本計画の初期に比して、マウスの背側に形成される毛色パターンが不鮮明になりがちで、その原因が飼育環境に因るものかどうか、検討を要する状態が続いており、系統の維持に注力せざるを得ない状況である。また抗体を用いて、Card14タンパク質の特異な領域と相互作用する因子の解析を行う計画は、使用する抗体の選抜とその特異性の検討がすすんだものの、まだ継続した検討が必要な段階である。さらには抗原のソースを十分に得るシステムの構築にも引き続き注力している。初代培養のマウスケラチノサイトを規模を大きくして培養しようとしたが、まだ試料としては量的に不十分な状況である。さらにCard14が関与する新たな情報系を可能にするマウス開発についても、上記解析を待ってより有効なマウスの作出を計画しているため、まだ進展していない。
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| Strategy for Future Research Activity |
毛周期に連関して、約30日周期で毛色の濃淡を繰り返す分子機構の解析基盤を、原因遺伝子であるCard14遺伝子の作用機序解明を通して構築することを目指した。
前述のように、使用する抗体の選抜とその特異性の検討を継続する必要がある。さらに、抗原のソースを十分に得るシステムの構築にも引き続き注力する。もしこれがうまくいかない場合は、我々が作製した各Card14変異体由来の（継代可能な）ケラチノサイト初代培養細胞の大量培養にこだわらず、内外で広く利用されているケラチノサイトの培養系を用いて、新たな実験系の確立を図ることも計画する。いずれにしても、当初から予定していたLC-MS解析に耐えられる試料を得られる系の構築が必要である。
また最終年度であるので、これまで優先させてきたウェット実験に加えて、当該遺伝子のアレル配列から、変異部位が担う作用機序をより詳細に予測することも計画する。変異部位が他のタンパク質との相互作用を予想させるコイルドコイル部位にあるので、新たなシグナル伝達系発見の端緒となることも期待できる。
昨年度に引き続き、今年度も矢嶋、田村、山本の全員が上記の点について解析を進める。我々が見出した「毛色と乾癬」の原因遺伝子と相互作用するタンパク質の新たな一面をぜひ明らかにしたいと思っている。
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