高機能化マイクロチップ電気泳動システムによる糖鎖、リン酸化の全自動解析
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20K06993
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 47020:Pharmaceutical analytical chemistry and physicochemistry-related
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山本 佐知雄 近畿大学, 薬学部, 講師 (10707954)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2020: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | マイクロチップ電気泳動 / リン酸化ペプチド / Phos-tag / アクリルアミドゲル / 糖鎖 / リン酸化タンパク質 |
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| Outline of Research at the Start |
ガンなどの疾病により発現する糖鎖やタンパク質のリン酸化状態が変化したという知見が数多く報告されているが，それぞれの翻訳後修飾がどのタイミングでどのように変化した結果，糖鎖構造やリン酸化状態が変化したという報告はない。これを解明するために前処理を含む一連の分析操作が特に困難な糖鎖や細胞のシグナル伝達に必要不可欠なリン酸化反応を明らかにするために，アクリルアミドゲル層と3次元型のマイクロチップを用いて糖鎖やリン酸化化合物の分析までに必要な前処理を含む一連の工程を流路中で行うことにより真のハイスループット分析を実現する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
高機能化マイクロチップ電気泳動システムによる糖鎖、リン酸化の全自動解析では、ガンなどの疾病によりタンパク質のリン酸化や糖鎖付加などの翻訳後修飾がどのタイミングでどのように変化するのかを解明する分析手段の開発について検討を行っている。目的とする分析法を開発するためには前処理を含む一連の分析操作を一枚のチップ上で電圧印加のみで達成できる条件の開発が必要となるが、特にターゲットとしている糖鎖やリン酸化などの翻訳後修飾はタンパク質重量から換算すると数%以下であることが多いため、本法を開発するためにはオンラインでの高感度検出に係る前処理を高効率に達成することが必要不可欠になる。本年度はリン酸化ペプチドのオンライン高感度検出に向けてリン酸化化合物を特異的に捕捉することが可能なPhos-tagを含有したアクリルアミドゲルを多分岐マイクロチップの流路にピンポイントで作製することによりリン酸化ペプチドの特異的濃縮、オンライン標識、分離・検出を電圧印加のみで達成できるシステムの検討を行った。市販のリン酸化ペプチドをfluoresceinisothiocyanate(FITC)で蛍光標識したものを試料として用い、マイクロチップの流路交差部に作製したPhos-tagアクリルアミドに電圧を印加して試料を導入した。その結果時間経過とともにPhos-tagアクリルアミドの蛍光強度の増大を確認することができ、特に試料濃度がゲル中に存在するPhos-tagの濃度以下の場合、Phos-tagの濃度依存的に濃縮が起こっていることを確認した。また、糖鎖に関しても糖鎖の認識部位が異なる2種類のレクチンを1枚のマイクロチップに作製することで、レクチンの認識部位に応じた特異的濃縮を実現した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和4年度はリン酸化ペプチドのオンライン高感度検出に向けてリン酸化化合物を特異的に捕捉することが可能なPhos-tagを含有したアクリルアミドゲルを多分岐のマイクロチップの流路にピンポイントで作製することによりリン酸化ペプチドの特異的濃縮法を開発した。
本来ならば、このオンライン標識法を糖ペプチドにも応用し、糖ペプチドとペリン酸化プチドを同時に検出できるシステムを作製する予定であったが、新型コロナウイルス感染症対策と研究室主催教授の変更に伴う所属学生の大幅な減少により、十分な実験を行うことが出来ず、予定よりもやや遅れた結果となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
従来の研究期間を1年延長して取り組むこととなった令和5年度は、前年度までの研究結果を組み合わせて以下の検討を行う。まずはタンパク質のトリプシン消化物を試料溶液として糖鎖付加とリン酸化修飾を同時に検出できるシステムの開発を目指す。このシステムが開発出来たのち細胞から総タンパク質を抽出するシステムとの組み合わせを実施する。
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Report
(3 results)
Research Products
(26 results)
