ミトコンドリアチャネルＶＤＡＣの立体構造解析によるオリゴマー構造と機能の解明

• Project/Area Number: 20K07062
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 47030:Pharmaceutical hygiene and biochemistry-related
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 染谷 友美 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 客員研究員 (80450401)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Project Status: Discontinued (Fiscal Year 2021)
• Budget Amount: ¥4,420,000 (Direct Cost: ¥3,400,000、Indirect Cost: ¥1,020,000); Fiscal Year 2023: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2022: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2021: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2020: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
• Keywords: 膜タンパク質無細胞合成 / オリゴマー / モノクローナル抗体 / ベータバレル構造 / 無細胞タンパク質合成 / チャネル / 立体構造認識抗体 / 構造解析 / 抗体

Outline of Research at the Start

本研究では、膜タンパク質立体構造を維持したまま免疫可能なリポソーム免疫法によりVDAC立体構造認識抗体を作成し、結晶性の向上を狙ったVDACタンパク質の高分解能結晶構造解析、VDAC・抗体複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析のいずれかまたは両方によるVDACオリゴマー構造解析を達成し、細胞死制御化合物の結合状態とオリゴマー形成への影響を調べる。

Outline of Annual Research Achievements

ミトコンドリア外膜に存在するアニオンチャネルVDACは、エネルギー生産の場であるミトコンドリアの機能に深く関わり、がんや神経変性疾患などの病態とも関連がある。これらの疾患に付随する細胞死に、VDACの高発現とオリゴマー化が関与している可能性が指摘されている。本研究では、膜タンパク質に適した免疫・スクリーニング方法でVDACに対する高親和性立体構造認識抗体を作成し、その抗体断片との複合体を形成させることにより、X線結晶構造解析およびクライオ電子顕微鏡単粒子解析を利用して高分解能のVDAC立体構造を決定し、さらに、脂質二重膜を含むナノディスク等へVDACを再構成して生体内環境でのオリゴマー状態を再現し、その構造を解析することを目指した。
脂質リポソームに再構成したVDAC1/2/3をマウスに免疫して抗体産生ハイブリドーマを作成し、立体構造認識抗体をスクリーニングして、ヒトVDAC1とヒトVDAC3を認識する抗体と、ヒトVDAC2を認識する抗体2クローンが得られた。各抗体クローンについて、様々な形状の抗体断片をリコンビナントタンパク質として発現するプラスミドを作成し、各抗体の各断片形状についてVDACとの結合解析と、それら複合体の性状分析を行った。引き続き、本抗体断片を用いたVDACのX線およびクライオ電顕による構造解析、オリゴマー解析を行う研究計画だったが、研究代表者の異動のため実施困難となり、最終年度を待たずに課題を廃止した。本研究により有用な抗体が得られたため、今後は、研究協力者や共同研究者によって構造解析、機能解析へ活用されることを期待している。また、それらの研究結果から、VDACオリゴマーの神経細胞死との関連が構造面から推定できると期待される。